PCR反應條件優化闡述
PCR反應條件的選擇技巧主要體現在溫度、時間和循環次數上，溫度過高，延伸時間不夠都會對實驗結果有很大的影響，以下看實戰總結方法技巧。PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。溫度與時間的設置：基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100～300bp時）可采用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。
1、變性溫度與時間：
變性(xing)溫(wen)度低(di)，解鏈不(bu)*是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃min足以(yi)使模(mo)板(ban)DNA變性(xing)，若低(di)于93℃則(ze)需延長時間，但(dan)溫(wen)度不(bu)能過高(gao)，因為高(gao)溫(wen)環境對酶的活(huo)性(xing)有(you)影響(xiang)。此步(bu)若不(bu)能使靶基因模(mo)板(ban)或(huo)PCR產物(wu)*變性(xing)，就會導致PCR失敗。
2、退火（復性）溫度與時間：
退(tui)火溫(wen)度(du)(du)是影響PCR特異(yi)性(xing)的(de)較重(zhong)要因(yin)素。變性(xing)后溫(wen)度(du)(du)快(kuai)速冷卻至40℃～60℃，可(ke)使引(yin)(yin)物(wu)和模(mo)板發生(sheng)結(jie)合。由于模(mo)板DNA 比引(yin)(yin)物(wu)復(fu)雜(za)得(de)多，引(yin)(yin)物(wu)和模(mo)板之間(jian)的(de)碰撞結(jie)合機會遠遠高于模(mo)板互補鏈之間(jian)的(de)碰撞。退(tui)火溫(wen)度(du)(du)與時(shi)間(jian)，取決(jue)于引(yin)(yin)物(wu)的(de)長(chang)(chang)度(du)(du)、堿基組成(cheng)及其濃度(du)(du)，還有靶基序列的(de)長(chang)(chang)度(du)(du)。對于20個核(he)苷酸，G+C含(han)量約50%的(de)引(yin)(yin)物(wu)，55℃為(wei)選擇最(zui)適(shi)退(tui)火溫(wen)度(du)(du)的(de)起(qi)點較為(wei)理想(xiang)。引(yin)(yin)物(wu)的(de)復(fu)性(xing)溫(wen)度(du)(du)可(ke)通過以下公式幫(bang)助選擇合適(shi)的(de)溫(wen)度(du)(du)：
Tm值（解鏈溫度）=4(G+C)+2(A+T)
復性溫度=Tm值(zhi)-(5～10℃）
在Tm值允許范(fan)圍內， 選(xuan)擇較高的復性溫度可(ke)大大減(jian)少引物和模(mo)板(ban)間(jian)的非特異性結合， 提高PCR反應的特異性。復性時間(jian)一(yi)般(ban)為30～60sec，足以使(shi)引物與模(mo)板(ban)之(zhi)間(jian)*結合。
3、延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：
70～80℃ 150核苷酸(suan)/S/酶分子
70℃ 60核(he)苷酸/S/酶分子(zi)
55℃ 24核苷酸(suan)/S/酶分(fen)子
高于90℃時(shi)， DNA合成幾乎不能(neng)進(jin)行。
PCR反(fan)應的(de)(de)(de)(de)延(yan)(yan)(yan)伸溫度(du)一般(ban)選擇(ze)在(zai)70～75℃之(zhi)間(jian)，常用溫度(du)為72℃，過(guo)高(gao)的(de)(de)(de)(de)延(yan)(yan)(yan)伸溫度(du)不利于(yu)引物(wu)和模板的(de)(de)(de)(de)結(jie)合。PCR延(yan)(yan)(yan)伸反(fan)應的(de)(de)(de)(de)時(shi)間(jian)，可(ke)根(gen)據待擴增(zeng)(zeng)(zeng)片段的(de)(de)(de)(de)長度(du)而定，一般(ban)1Kb以內的(de)(de)(de)(de)DNA片段，延(yan)(yan)(yan)伸時(shi)間(jian)1min是足夠 的(de)(de)(de)(de)。3～4kb的(de)(de)(de)(de)靶序(xu)列需3～4min；擴增(zeng)(zeng)(zeng)10Kb需延(yan)(yan)(yan)伸至15min。延(yan)(yan)(yan)伸時(shi)間(jian)過(guo)長會(hui)導致非特異性擴增(zeng)(zeng)(zeng)帶(dai)的(de)(de)(de)(de)出現。對低濃度(du)模板的(de)(de)(de)(de)擴增(zeng)(zeng)(zeng)，延(yan)(yan)(yan)伸時(shi)間(jian)要(yao)稍長些。
