PCR反應條件優化闡述

      PCR反應條件的選擇技巧主要體現在溫度、時間和循環次數上，溫度過高，延伸時間不夠都會對實驗結果有很大的影響，以下看實戰總結方法技巧。PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。溫度與時間的設置：基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100～300bp時）可采用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。

1、變性溫度與時間：

變(bian)(bian)性溫(wen)度低，解鏈不(bu)*是導致PCR失敗(bai)的最主要原因(yin)。一般情況下，93℃～94℃min足以使(shi)(shi)模(mo)板DNA變(bian)(bian)性，若低于93℃則需延長時間，但溫(wen)度不(bu)能過高(gao)，因(yin)為高(gao)溫(wen)環境對(dui)酶的活性有(you)影響(xiang)。此步若不(bu)能使(shi)(shi)靶基因(yin)模(mo)板或PCR產物*變(bian)(bian)性，就會導致PCR失敗(bai)。

2、退火（復性）溫度與時間：

退火(huo)(huo)溫度(du)(du)是影(ying)響PCR特異(yi)性(xing)的(de)(de)較重要因素。變性(xing)后溫度(du)(du)快速冷(leng)卻(que)至40℃～60℃，可使(shi)引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)和模板(ban)(ban)發生結(jie)合。由于(yu)模板(ban)(ban)DNA 比引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)復雜(za)得多(duo)，引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)和模板(ban)(ban)之(zhi)間(jian)的(de)(de)碰(peng)撞結(jie)合機會遠遠高于(yu)模板(ban)(ban)互補鏈之(zhi)間(jian)的(de)(de)碰(peng)撞。退火(huo)(huo)溫度(du)(du)與時(shi)間(jian)，取決于(yu)引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)的(de)(de)長度(du)(du)、堿基(ji)組成(cheng)及其(qi)濃度(du)(du)，還有靶基(ji)序列(lie)的(de)(de)長度(du)(du)。對于(yu)20個核(he)苷酸，G+C含量約50%的(de)(de)引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)，55℃為選(xuan)擇(ze)最適退火(huo)(huo)溫度(du)(du)的(de)(de)起點較為理(li)想。引(yin)(yin)(yin)(yin)物(wu)的(de)(de)復性(xing)溫度(du)(du)可通過(guo)以(yi)下公式幫助(zhu)選(xuan)擇(ze)合適的(de)(de)溫度(du)(du)：

Tm值(zhi)（解鏈溫度）=4(G+C)+2(A+T)

復性溫度=Tm值-(5～10℃）

在(zai)Tm值允(yun)許范(fan)圍內， 選(xuan)擇(ze)較高的復(fu)性溫度可大大減(jian)少引(yin)物和模板間的非特(te)異(yi)性結(jie)合(he)， 提(ti)高PCR反應的特(te)異(yi)性。復(fu)性時間一般為30～60sec，足以使引(yin)物與模板之間*結(jie)合(he)。

3、延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：

70～80℃ 150核苷(gan)酸/S/酶分子

70℃ 60核(he)苷酸(suan)/S/酶分(fen)子

55℃ 24核(he)苷酸/S/酶分子(zi)

高于(yu)90℃時， DNA合成幾乎(hu)不(bu)能進行。

PCR反應(ying)的(de)(de)(de)延(yan)(yan)伸(shen)(shen)溫(wen)度(du)(du)(du)一般選(xuan)擇在70～75℃之(zhi)間(jian)，常用溫(wen)度(du)(du)(du)為72℃，過高(gao)的(de)(de)(de)延(yan)(yan)伸(shen)(shen)溫(wen)度(du)(du)(du)不利于(yu)引物和(he)模(mo)板(ban)的(de)(de)(de)結合(he)。PCR延(yan)(yan)伸(shen)(shen)反應(ying)的(de)(de)(de)時間(jian)，可(ke)根據待擴(kuo)增(zeng)片段的(de)(de)(de)長度(du)(du)(du)而定(ding)，一般1Kb以內的(de)(de)(de)DNA片段，延(yan)(yan)伸(shen)(shen)時間(jian)1min是足夠 的(de)(de)(de)。3～4kb的(de)(de)(de)靶序列需(xu)3～4min；擴(kuo)增(zeng)10Kb需(xu)延(yan)(yan)伸(shen)(shen)至(zhi)15min。延(yan)(yan)伸(shen)(shen)時間(jian)過長會導致(zhi)非特異性擴(kuo)增(zeng)帶(dai)的(de)(de)(de)出(chu)現。對低濃度(du)(du)(du)模(mo)板(ban)的(de)(de)(de)擴(kuo)增(zeng)，延(yan)(yan)伸(shen)(shen)時間(jian)要稍長些(xie)。