PCR試劑盒實驗反應出問題探究

       PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚(ju)合酶鏈式反(fan)(fan)應，可(ke)以選(xuan)擇性(xing)(xing)擴(kuo)增(zeng)一段DNA序(xu)列。其基本步驟(zou)是，首先將待(dai)擴(kuo)增(zeng)的(de)(de)(de)(de)模板DNA變性(xing)(xing)使之成(cheng)為單鏈，DNA樣品(pin)中，特異(yi)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)引物(wu)能(neng)夠與(yu)其互(hu)(hu)補(bu)的(de)(de)(de)(de)序(xu)列雜交，在(zai)(zai)dNTPs和Taq酶存在(zai)(zai)時，就(jiu)可(ke)以合成(cheng)模板DNA的(de)(de)(de)(de)互(hu)(hu)補(bu)鏈，反(fan)(fan)應完成(cheng)后(hou)，將反(fan)(fan)應混合物(wu)加(jia)熱使DNA雙鏈變性(xing)(xing)，溫度(du)下降后(hou)，過量的(de)(de)(de)(de)引物(wu)又可(ke)以開始第二(er)輪(lun)的(de)(de)(de)(de)合成(cheng)反(fan)(fan)應。這(zhe)種延伸-變性(xing)(xing)-退火-延伸的(de)(de)(de)(de)循環可(ke)以重復多次(ci)，使所需要的(de)(de)(de)(de)DNA片段得(de)到(dao)特異(yi)性(xing)(xing)的(de)(de)(de)(de)擴(kuo)增(zeng)。PCR檢測試劑盒反(fan)(fan)應失敗的(de)(de)(de)(de)原因及(ji)解決(jue)方法(fa)如下：

一 、模板質量問題：
1、模板提取不完整，其中不含你的目的基因，或目的基因含量太低。可以跑個電泳看看提取的DNA，PCR陽性樣品與陰性樣品是否有明顯差別。如果確定是這種問題，可以增加模板量試試，但不一定行得通。

2、模板里面殘留某種試劑成份，可能抑制Taq聚合酶的活性，如果是這種情況，可以用試劑盒把模板再純化一下，或將模板做個梯度稀釋以確定最佳的模板量。

3、為什(shen)么跑電泳會出(chu)現拖帶呢？

1）. 有可能的因為你的電壓調的太高了。電泳跟很多因素有關，其中就有一個是電壓，在適當的電壓范圍內增加是可以加快遷移速率，但是要是超到一個臨界值反而有害。你可以適當的調低點看看。

2）.有時候發現上樣量太多的話會有拖帶。你看能否回收之后 ，按1:50 或1:100 等稀釋后，再當成模板擴一次怎么樣。

二 、引物問題
1）、樣品自身的基因型差異導致擴增失敗。也就是說你的引物與某些基因型的樣品結合的好，而和另一些基因型結合不好。可以換一對更保守的引物試試。祝順利！

2）、普通PCR所用的一對引物中有一個引物加多了，為正常的三倍只要引物特異性比較好，那么不會產生大的影響。如果恰巧是加多的這條引物不是很特異的話，也許會擴出來非特異帶。

在制備單鏈探針時候就采取這樣的不對稱pcr，沒關系的三Taq酶處于失活狀態。因為活性降低了能出現二聚體。

三、Taq酶處于失活狀態。因為活性降低了能出現二聚體。

四、模板濃度過低。

五、退火溫度過高。有可能，可以做個梯度PCR試一下。

六、循環次數過少或延伸時間過短以致目的基因擴增量不夠。這個可能性不大。

七、dNTP濃度低時PCR產率及特異性均增高，適合于用擴增摻入法標記生物素及放射性元素。當100μl PCR液中含dNTP各40μmol/L時就足以合成2.6μg的DNA（dNTP消耗一半）,所以,你不小心多加了4倍的量,會很影響PCR結果,即Taq酶活力要降低20～30%，即底物抑制。

八、PCR產物電泳
1.電泳圖不清晰，可能電泳緩沖液和制膠緩沖液濃度不準或者臟了吧。換新的電泳緩沖液和制膠緩沖液試試。marker都出問題說明是膠的問題，或者電泳操作的問題。

2. PCR擴增(zeng)有時(shi)出現涂抹帶或(huo)片狀(zhuang)帶或(huo)地(di)毯樣(yang)帶。其原因往往由于酶(mei)(mei)量過(guo)多或(huo)酶(mei)(mei)的(de)質量差，dNTP濃度過(guo)高，Mg2+濃度過(guo)高，退(tui)火(huo)溫度過(guo)低(di)，循環次數過(guo)多引起。