在PCR反應體系(xi)中加入熒光(guang)基團，利用(yong)熒光(guang)信號積累(lei)實時監測整個(ge)PCR進程，使(shi)每一個(ge)循環變得“可見”，最后通(tong)過循環閾(yu)值( Cycle threshold，Ct) 和標(biao)準(zhun)曲(qu)線的關系(xi)對起(qi)始(shi)模板進行定量(liang)分析。

       PCR擴增過程中，每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度。隨著反應循環次數的不斷增加，所擴增的目的基因片段呈指數規律增長，反應中產生的熒光信號強度與PCR產物的數量呈正比。儀器實時檢測和采集的熒光信號，隨著時間和循環數的不斷增加，產生一條反映實時熒光信號強度變化的曲線，稱為擴增曲線。

擴(kuo)增(zeng)曲線以循環數為(wei)橫(heng)坐標，熒光強度為(wei)縱坐標。樣(yang)本擴(kuo)增(zeng)曲線是(shi)反(fan)應(ying)PCR進程的(de)鏡(jing)子，我們可以通過觀察擴(kuo)增(zeng)曲線來(lai)評估PCR擴(kuo)增(zeng)效率(lv)，分(fen)析實驗是(shi)否順利(li)進行。擴(kuo)增(zeng)曲線的(de)正常與否，反(fan)映出(chu)實驗中存在(zai)的(de)諸多因素和問題，對核酸檢測(ce)結果判讀十分(fen)重要。

 正(zheng)常(chang)狀態擴(kuo)增曲線(xian)(xian)：正(zheng)常(chang)PCR擴(kuo)增曲線(xian)(xian)呈“S”型，分為基(ji)線(xian)(xian)期(qi)、指數期(qi)、線(xian)(xian)性期(qi)、平(ping)臺期(qi)。擴(kuo)增曲線(xian)(xian)良好(hao)的指標是曲線(xian)(xian)拐點清楚，擴(kuo)增曲線(xian)(xian)整體(ti)平(ping)?性好(hao)，基(ji)線(xian)(xian)平(ping)??上(shang)揚現象。

1、基線期

PCR起始時(shi)，剛開始前幾個循環的(de)熒光信(xin)號(hao)還沒有(you)發生變化，接近一條直線(xian)(xian)，將其稱之為基線(xian)(xian)，一般是3-15個循環。在基線(xian)(xian)期內(nei)，擴增的(de)熒光信(xin)號(hao)被背景熒光信(xin)號(hao)所掩蓋(gai)，無法判斷PCR產物量的(de)變化。

2、指數期

擴(kuo)(kuo)增(zeng)的熒(ying)光信(xin)號(hao)高(gao)于背景熒(ying)光信(xin)號(hao)，擴(kuo)(kuo)增(zeng)曲線起峰，開始進(jin)入指(zhi)數期(qi)。在(zai)指(zhi)數期(qi)內(nei)，每個循環積聚的產(chan)物(wu)準確(que)加倍（假定(ding)100%反(fan)(fan)應(ying)效率）。該階段(duan)的PCR反(fan)(fan)應(ying)具有高(gao)度(du)特異性和精確(que)度(du)。因為(wei)所有試劑均充(chong)足，反(fan)(fan)應(ying)的動力學推動反(fan)(fan)應(ying)有利(li)于擴(kuo)(kuo)增(zeng)子加倍，所以產(chan)物(wu)出現(xian)指(zhi)數級擴(kuo)(kuo)增(zeng)。只有在(zai)這個階段(duan)，Cq值(zhi)與初始模板量(liang)的對數之(zhi)間存在(zai)線性關系，所以在(zai)此(ci)階段(duan)進(jin)行定(ding)量(liang)分析最(zui)合適(shi)。

3、線性期（高變異性）

隨著PCR反應(ying)體系各成(cheng)分的(de)消耗(hao)，其中(zhong)的(de)一種或(huo)者(zhe)多種成(cheng)分限(xian)制反應(ying)，導致反應(ying)開始減緩，并且每個(ge)循環的(de)PCR產物不再加(jia)倍，該階段(duan)不再是指數級擴增。

4、平臺期

反應停止(zhi)，不再產生(sheng)更(geng)多產物(wu)，并(bing)且如果(guo)放(fang)置(zhi)時(shi)間夠(gou)長，PCR產物(wu)將開始(shi)降解。因為每(mei)個(ge)樣(yang)品具有不同的反應動力(li)學，所以(yi)每(mei)支試管(guan)或每(mei)個(ge)反應將在不同的時(shi)間點進入平(ping)臺期，最終的產物(wu)含量也各不相同。

由于線性(xing)期(qi)和平臺期(qi)的(de)擴(kuo)增產物(wu)已不(bu)再呈指數級(ji)的(de)增加，PCR的(de)產物(wu)量(liang)(liang)與初始(shi)模(mo)板量(liang)(liang)之間沒有線性(xing)關系(xi)，所以也不(bu)能(neng)通過這兩個階段的(de)PCR產物(wu)量(liang)(liang)計算出初始(shi)模(mo)板量(liang)(liang)。想要知道初始(shi)模(mo)板量(liang)(liang)的(de)多少，還要依賴(lai)指數期(qi)的(de)Cq值進行計算。

理論上，PCR每個循環后擴增(zeng)(zeng)產物量即增(zeng)(zeng)加(jia)一倍，擴增(zeng)(zeng)曲線(xian)應表(biao)現為熒光(guang)值隨著循環數(shu)增(zeng)(zeng)加(jia)而不斷上升。

實際上(shang)，擴(kuo)(kuo)增(zeng)曲線(xian)的熒光值并不會隨(sui)著循環(huan)數(shu)的增(zeng)加而無限上(shang)升。這是由于PCR擴(kuo)(kuo)增(zeng)進(jin)行(xing)到(dao)一定階段，反(fan)應體系中的原料發(fa)生消(xiao)耗和(he)變(bian)性，如(ru)dNTP和(he)酶等原料相對于模(mo)板減(jian)少(shao)，同(tong)時酶活性逐漸達到(dao)飽(bao)和(he)；引物二聚體和(he)反(fan)應亞產(chan)物（如(ru)焦磷酸）的產(chan)生也會抑制擴(kuo)(kuo)增(zeng)反(fan)應；引物和(he)已(yi)擴(kuo)(kuo)增(zeng)的DNA片段間的競爭等都會導(dao)致PCR的擴(kuo)(kuo)增(zeng)效率逐步(bu)降低，直至為0。因此，擴(kuo)(kuo)增(zeng)曲線(xian)表現為擴(kuo)(kuo)增(zeng)到(dao)一定的循環(huan)數(shu)后(hou)，熒光值不再(zai)隨(sui)著循環(huan)數(shu)發(fa)生變(bian)化，而是保持平坦，出現平臺期。