ELISA酶聯免疫吸附試驗測定結果判斷

ELISA酶聯免疫吸附測定是一種廣泛應用于生物分子檢的生物技術。在定性測定中，ELISA通過酶標記的抗體與待測抗原之間的特異性結合，將抗原的存在與否轉化為可觀測的信號，從而實現對目標分子的快速、準確判斷。

 在(zai)進(jin)行ELISA定性測(ce)定時，通常采用顏色反應(ying)作為(wei)判斷依據。當酶(mei)標(biao)記的抗(kang)(kang)體與(yu)(yu)抗(kang)(kang)原結合后，酶(mei)的催化(hua)作用會使底物發生顏色變化(hua)，這種變化(hua)可(ke)以通過肉(rou)眼或儀器進(jin)行觀測(ce)。通過設定合適的閾值或參考(kao)標(biao)準，我們可(ke)以對樣品中抗(kang)(kang)原的存在(zai)與(yu)(yu)否進(jin)行定性判斷。

 ELISA定性測定的結果判斷是對受檢標本中是否含有待測抗原或抗體作出 "有"或"無"的簡單回答，分別用"陽性"、"陰性"表示。"陽性"表示該標本在該測定系統中有反應。"陰性"則為無反應。用定性判斷法也可得到半定量結果，即用滴度來表示反應的強度，其實質仍是一個定性試驗。在這種半定量測定中，將標本作一系列稀釋后進行試驗，呈陽性反應的稀釋度即為滴度。根據滴度的高低，可以判斷標本反應性的強弱，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性具定量意義。在間接法和夾心法 ELSIA中，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應的結果判斷方法不同，分述于下。

1、  間接法和夾心法

這類(lei)(lei)反(fan)應(ying)的定性(xing)(xing)結(jie)果(guo)可以用(yong)(yong)肉眼判斷。目視標本也無色或近于(yu)無色者判為(wei)陰(yin)(yin)性(xing)(xing)，顯色清(qing)晰者為(wei)陽性(xing)(xing)。但在 ELSIA中，正常人血(xue)清(qing)反(fan)應(ying)后常可出現呈色的本底(di)，此本底(di)的深淺(qian)因試(shi)劑的組成和(he)實(shi)(shi)驗的條(tiao)件不同而異，因此實(shi)(shi)驗中必須加測陰(yin)(yin)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)。陰(yin)(yin)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)的組成應(ying)為(wei)不含受檢(jian)物的正常血(xue)清(qing)或類(lei)(lei)似物。在用(yong)(yong)肉眼判斷結(jie)果(guo)時，宜用(yong)(yong)顯色深于(yu)陰(yin)(yin)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)作為(wei)標本陽性(xing)(xing)的指(zhi)標。目視法(fa)簡捷(jie)明了(le)，但頗具主觀性(xing)(xing)。在條(tiao)件許可下，應(ying)該用(yong)(yong)比(bi)色計(ji)(ji)測定吸(xi)光(guang)值(zhi)(zhi)，這樣可以得(de)到客觀的數據。先讀出標本（sample，S）、陽性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)（P）、和(he)陰(yin)(yin)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)（N）的吸(xi)光(guang)值(zhi)(zhi)，然后進行計(ji)(ji)算(suan)。計(ji)(ji)算(suan)方法(fa)有多種，大致可分為(wei)陽性(xing)(xing)判定值(zhi)(zhi)法(fa)和(he)標本與陰(yin)(yin)性(xing)(xing)對(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)比(bi)值(zhi)(zhi)法(fa)兩類(lei)(lei)。

a. 陽性判定值

陽性判(pan)定(ding)(ding)值（cut-off value）一般為陰(yin)性對(dui)照A值加上(shang)一個特定(ding)(ding)的常(chang)數，以(yi)此作為判(pan)斷結(jie)果陽性或(huo)陰(yin)性的標準。

用此(ci)法判(pan)斷結(jie)果要求實(shi)驗(yan)條件十(shi)分恒(heng)定(ding)，試劑(ji)(ji)的(de)制(zhi)備必須標(biao)準化，陽性(xing)(xing)和(he)陰(yin)性(xing)(xing)的(de)對(dui)(dui)(dui)(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)品應符合(he)一(yi)定(ding)的(de)規格，須配用的(de)儀器(qi)，并(bing)嚴格按(an)規定(ding)操作。陽性(xing)(xing)判(pan)定(ding)值(zhi)公式中(zhong)的(de)常數是在(zai)這特(te)定(ding)的(de)系(xi)統(tong)中(zhong)通過對(dui)(dui)(dui)(dui)大量(liang)標(biao)本的(de)實(shi)驗(yan)檢(jian)(jian)測而得到的(de)。現舉某種檢(jian)(jian)測 HBsAg的(de)試劑(ji)(ji)盒(he)為例(li)。試劑(ji)(ji)盒(he)中(zhong)的(de)陰(yin)性(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)品為不含(han)HBsAg的(de)復(fu)鈣(gai)人血漿，陽性(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)品HBsAg的(de)含(han)量(liang)標(biao)明為P=9±2ng /ml。每次試驗(yan)設2個(ge)(ge)陽性(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)和(he)3個(ge)(ge)陰(yin)性(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)。測得A值(zhi)后，先計(ji)算(suan)陰(yin)性(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)A值(zhi)的(de)平(ping)(ping)均(jun)數（NC X ）和(he)陽性(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)A值(zhi)的(de)平(ping)(ping)均(jun)數（PCX），兩個(ge)(ge)平(ping)(ping)均(jun)數的(de)差（P-N）必須大于一(yi)個(ge)(ge)特(te)定(ding)的(de)數值(zhi)（例(li)0.400），試驗(yan)才(cai)有效(xiao)。3個(ge)(ge)陰(yin)性(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)A值(zhi)均(jun)應≥0.5×NCX，并(bing)≤1.5×NCX，如(ru)其(qi)中(zhong)之一(yi)超出(chu)(chu)此(ci)范圍，則棄去，而已另兩個(ge)(ge)陰(yin)性(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)重新(xin)計(ji)算(suan)NCX；如(ru)有兩個(ge)(ge)陰(yin)性(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)(dui)照(zhao)(zhao)(zhao)A值(zhi)超出(chu)(chu)以上(shang)范圍，則該(gai)次實(shi)驗(yan)無(wu)效(xiao)。陽性(xing)(xing)判(pan)定(ding)值(zhi)按(an)下式計(ji)算(suan)：

陽性判定值=NCX+0.05

標(biao)本 A值＞陽(yang)性判定(ding)值的為陽(yang)性，小于陽(yang)性判定(ding)值的為陰性。應注意的是，式中0.05為該(gai)試(shi)劑(ji)盒(he)的常(chang)數(shu)，只適合于該(gai)特定(ding)條件下，而不是對各種試(shi)劑(ji)均可通用。

根據(ju)以上敘述可以看出(chu)，在這種(zhong)方(fang)法中陰性對(dui)照和陽性對(dui)照也起(qi)到試(shi)驗的(de)質控(kong)作(zuo)用，試(shi)劑變質和操作(zuo)不(bu)當(dang)均會產生"試(shi)驗無效"的(de)后果。

b. 標本/陰性對照比值

在實驗(yan)條件(jian)（包括試(shi)劑）較難保證恒定的(de)(de)情(qing)況(kuang)下，這(zhe)種判斷法較為(wei)合適。在得出標本(ben)（ S）和(he)陰性(xing)(xing)對照（N）的(de)(de)A值(zhi)后，計(ji)算S/N值(zhi)。也有(you)寫(xie)作P/N的(de)(de)，這(zhe)里(li)的(de)(de)P不代表陽性(xing)(xing)(positive)，而是病人(ren)（patient）的(de)(de)縮寫(xie)，不應誤解。為(wei)避免混淆，宜用(yong)S/N表示(shi)。在早期的(de)(de)間(jian)接法ELISA中(zhong)(zhong)，有(you)些作者定出S/N為(wei)陽性(xing)(xing)標準，現多為(wei)各種測(ce)定所沿用(yong)。實際(ji)上每(mei)一測(ce)定系統應該用(yong)實驗(yan)求出各自的(de)(de)S/N的(de)(de)閾值(zhi)。應注意的(de)(de)是，N所代表的(de)(de)陰性(xing)(xing)對照是不含受檢物質(zhi)的(de)(de)人(ren)血(xue)清(qing)。有(you)的(de)(de)試(shi)劑盒中(zhong)(zhong)所設(she)陰性(xing)(xing)對照為(wei)不含蛋(dan)白質(zhi)或蛋(dan)白質(zhi)含量較底的(de)(de)緩沖液，以致(zhi)反應后產生(sheng)的(de)(de)本(ben)底可能(neng)較正常人(ren)血(xue)清(qing)的(de)(de)本(ben)底低得多。因(yin)此，這(zhe)類試(shi)劑盒規，如N<0.05（或其(qi)他數(shu)值(zhi)），則(ze)按0.05計(ji)算，否則(ze)將出現假陽性(xing)(xing)結果。

2、 競爭法

在競(jing)(jing)爭(zheng)法 ELISA中(zhong)(zhong)，陰(yin)性(xing)孔呈色深于陽性(xing)孔。陰(yin)性(xing)呈色的(de)(de)強度取決于反(fan)應中(zhong)(zhong)酶結(jie)合物的(de)(de)濃度和(he)加入競(jing)(jing)爭(zheng)抑制物的(de)(de)量，一般(ban)調節陰(yin)性(xing)對照的(de)(de)吸光度在1.0-1.5之間(jian)，此時反(fan)應為敏(min)感(gan)。

競爭(zheng)法 ELISA不易用自(zi)視判(pan)斷結果(guo)，因肉眼很(hen)難(nan)辨別弱陽性(xing)(xing)反(fan)應與陰(yin)性(xing)(xing)對照的顯(xian)色(se)(se)差(cha)異，一般均用比色(se)(se)計測定，讀出S、P和(he)N的吸光值(zhi)。計算方法主要也有兩種，即陽性(xing)(xing)判(pan)定值(zhi)法和(he)抑制率法。

a. 陽性判定值法

與間接法和(he)(he)夾心法中(zhong)的陽(yang)性(xing)(xing)(xing)(xing)判(pan)定值(zhi)(zhi)法基本相同(tong)，但在計算公(gong)式(shi)中(zhong)引(yin)入陽(yang)性(xing)(xing)(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)(dui)照(zhao) A值(zhi)(zhi)，現舉某種檢測抗HBc的試劑盒(he)為(wei)例(li)。試劑盒(he)中(zhong)的陰(yin)性(xing)(xing)(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)(dui)照(zhao)為(wei)不含(han)抗HBc的復鈣(gai)人血漿(jiang)，陽(yang)性(xing)(xing)(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)(dui)照(zhao)中(zhong)抗HBc含(han)量為(wei)125±1 00u/ml。每次試驗設2個(ge)(ge)(ge)陽(yang)性(xing)(xing)(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)(dui)照(zhao)和(he)(he)3個(ge)(ge)(ge)陰(yin)性(xing)(xing)(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)(dui)照(zhao)。測得A值(zhi)(zhi)后，先計算陰(yin)性(xing)(xing)(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)(dui)照(zhao)A值(zhi)(zhi)的平(ping)(ping)均(jun)值(zhi)(zhi)（NC X ）和(he)(he)陽(yang)性(xing)(xing)(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)(dui)照(zhao)A值(zhi)(zhi)的平(ping)(ping)均(jun)數(shu)(shu)（PCX），兩個(ge)(ge)(ge)平(ping)(ping)均(jun)數(shu)(shu)的差（N-P）必(bi)須大于一個(ge)(ge)(ge)特定的數(shu)(shu)值(zhi)(zhi)（例(li)如(ru)0.300）,試驗才有(you)效(xiao)。3個(ge)(ge)(ge)陰(yin)性(xing)(xing)(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)(dui)照(zhao)A值(zhi)(zhi)均(jun)應小于2.000，而且(qie)應≥0.5×NCX并≤1.5×NCX，如(ru)其中(zhong)之(zhi)一超(chao)出此范圍，則(ze)棄去(qu)，而以另2個(ge)(ge)(ge)陰(yin)性(xing)(xing)(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)(dui)照(zhao)重新計算×NCX；如(ru)有(you)2個(ge)(ge)(ge)陰(yin)性(xing)(xing)(xing)(xing)對(dui)(dui)(dui)(dui)照(zhao)A超(chao)出以上范圍，則(ze)該次實驗無效(xiao)。陽(yang)性(xing)(xing)(xing)(xing)判(pan)定值(zhi)(zhi)按下式(shi)計算：

陽性判定值(zhi)=0.4×NCX+0.6×PCX

標(biao)本(ben)A值≤陽(yang)性判定值的反(fan)(fan)應(ying)為(wei)(wei)陽(yang)性，A＞陽(yang)性判定值的反(fan)(fan)應(ying)為(wei)(wei)陰性。

b. 抑制率法

抑制(zhi)(zhi)率表(biao)示標本在競(jing)爭結合中標本對陰(yin)性反應顯色的抑制(zhi)(zhi)程度，按下式計算：

抑制(zhi)率(lv)（%）= （陰性(xing)對(dui)照A值(zhi)-標(biao)本A值(zhi)）×/陰性(xing)對(dui)照A值(zhi)

一般規定抑制率≥50%為陽性，＜50%為陰性。

ELISA定性(xing)(xing)測定通(tong)(tong)過(guo)酶標記抗體與抗原的(de)特異性(xing)(xing)結(jie)合及(ji)顏色反應(ying)的(de)觀察(cha)，實現(xian)了對目(mu)標分(fen)子的(de)快(kuai)速、準(zhun)確(que)判斷(duan)。在實際應(ying)用(yong)中(zhong)，需(xu)要注意(yi)操(cao)作的(de)規(gui)范性(xing)(xing)、試(shi)劑(ji)的(de)選擇和(he)(he)實驗條(tiao)件的(de)優化(hua)，以(yi)確(que)保結(jie)果(guo)的(de)可靠(kao)性(xing)(xing)。通(tong)(tong)過(guo)不斷(duan)改(gai)進(jin)和(he)(he)優化(hua)實驗方法，進(jin)一(yi)步提(ti)高ELISA定性(xing)(xing)測定的(de)準(zhun)確(que)性(xing)(xing)和(he)(he)效(xiao)率。