ELISA實驗操作重點：顯色及比色

 ELISA檢測是一(yi)種免疫(yi)檢測(ce)方法，通(tong)常用于測(ce)量生(sheng)物樣(yang)品中(zhong)的(de)抗(kang)(kang)體或抗(kang)(kang)原，包括蛋(dan)白質或糖蛋(dan)白。像其他免疫(yi)檢測(ce)法一(yi)樣(yang)，它們(men)依靠抗(kang)(kang)體與目(mu)標的(de)結(jie)合來促(cu)進檢測(ce)。

如果你是HRP的二抗，顯色液A、B的成分一般是H2O2和TMB（或OPD），至于具體A是那一個B是那一個你要看說明書。
HRP催化過氧化物H2O2，其反應式如下：

D＝TMB（或OPD）
DH2+ H2O2＝ D+2H2O
上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無色化合物，經酶作用后成為有色的產物，以便作比色測定。
　　顯色是ELISA中的后一步溫育反應，此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。
　　適當提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中，加入底物后的反應溫度和時間應按規定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行，時間一般不需要嚴格控制，有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯se情況適當縮短或延長反應時間，及時判斷。
OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深，再延長反應時間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反應應避光進行，顯色反應結束時加入終止液終止反應。OPD產物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉向棕黃色。
TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩定性，宜在規定的適當時間閱讀結果。TMB經HRP作用后，約40分鐘顯色達，隨即逐漸減弱，至2小時后即可*消退至無色。
TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-24小時)不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色，此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。

二、比色
　　比(bi)色前(qian)應(ying)先用潔凈(jing)的(de)(de)吸水(shui)紙拭干板底附著的(de)(de)液體，然后將板正確(que)放入酶標比(bi)色儀的(de)(de)比(bi)色架(jia)中。以軟(ruan)板為(wei)載(zai)體的(de)(de)試(shi)驗(yan)，需先將板置于標準96孔的座架中，才可進行比色。
　　在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈，這樣，此板就可*平妥坐入座架中。 比色時應先以蒸餾水校零點，測讀底物孔(未經任何反應僅加底物液的孔)和空白孔(以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔)，以記錄本次試驗的試劑狀況。
　　其(qi)后(hou)可用空白孔以蒸餾水校零(ling)點，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然(ran)后(hou)進行計算。
　　比色結果的表達以往通用光密度(oplical density，OD)，現按規定用吸光度(absorbence，A)，兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。