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ELISA實驗操作重點:顯色及比色

 ELISA檢測是一(yi)種免疫(yi)檢測(ce)方法,通(tong)常用于測(ce)量生(sheng)物樣(yang)品中(zhong)的(de)抗(kang)(kang)體或抗(kang)(kang)原,包括蛋(dan)白質或糖蛋(dan)白。像其他免疫(yi)檢測(ce)法一(yi)樣(yang),它們(men)依靠抗(kang)(kang)體與目(mu)標的(de)結(jie)合來促(cu)進檢測(ce)。


一、顯色
ELISA試劑盒里的顯色液AB成分

如果你是HRP的二抗,顯色液AB的成分一般是H2O2TMB(或OPD),至于具體A是那一個B是那一個你要看說明書。
HRP催化過氧化物H2O2,其反應式如下:

DTMB(或OPD
DH2+ H2O2= D+2H2O
上式中,DH2為供氧體,H2O2為受氫體。在ELISA中,DH2一般為無色化合物,經酶作用后成為有色的產物,以便作比色測定。
  顯色是ELISA中的后一步溫育反應,此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內,陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。
  適當提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中,加入底物后的反應溫度和時間應按規定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行,時間一般不需要嚴格控制,有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯se情況適當縮短或延長反應時間,及時判斷。
OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深,再延長反應時間,可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色,顯色反應應避光進行,顯色反應結束時加入終止液終止反應。OPD產物用硫酸終止后,顯色由橙黃色轉向棕黃色。
TMB受光照的影響不大,可在室溫中置于操作臺上,邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩定性,宜在規定的適當時間閱讀結果。TMBHRP作用后,約40分鐘顯色達,隨即逐漸減弱,至2小時后即可*消退至無色。
TMB的終止液有多種,疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-24小時)不褪,是目視判斷的良好終止劑。此外,各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色,此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。

二、比色

  比(bi)色前(qian)應(ying)先用潔凈(jing)的(de)(de)吸水(shui)紙拭干板底附著的(de)(de)液體,然后將板正確(que)放入酶標比(bi)色儀的(de)(de)比(bi)色架(jia)中。以軟(ruan)板為(wei)載(zai)體的(de)(de)試(shi)驗(yan),需先將板置于標準96孔的座架中,才可進行比色。
  在加底物液顯色前,先將軟板邊緣剪凈,這樣,此板就可*平妥坐入座架中。 比色時應先以蒸餾水校零點,測讀底物孔(未經任何反應僅加底物液的孔)和空白孔(以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔),以記錄本次試驗的試劑狀況。
  其(qi)后(hou)可用空白孔以蒸餾水校零(ling)點,以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度,然(ran)后(hou)進行計算。
  比色結果的表達以往通用光密度(oplical densityOD),現按規定用吸光度(absorbenceA),兩者含義相同。通常的表示方法是,將吸收波長寫于A字母的右下角,如OPD的吸收波長為492nm,表示方法為"A492nm""OD492nm"

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