ELISA酶聯免疫吸附試驗“花板”現象探究

        酶聯免疫吸附試驗(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay， ELISA)于1971年分別由瑞典學者和荷蘭學者報道，開創了運用酶標記免疫技術進行液體標本中微量物質測定的實驗方法。其原理是抗原或抗體的固相化及抗原抗體的酶標記。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，由此進行定性或定量分析。該實驗因其靈敏度較高，特異性較好，操作較簡單，可大批量操作而廣泛應用于多種傳染性疾病的篩查工作中。然而，“花板"現象的出現，往往會給實驗者判讀結果帶來麻煩。所謂“花板"，就是空白、陰性、陽性對照及室內質控孔結果正常，而標本孔的OD值卻偏高，弱陽性結果較多。現對“花板"現象進行了分析和總結，認為花板原因大多在樣品，解決辦法主要在洗滌，孵育和顯色過程也會導致。

一、 花板原因大多在樣品
所謂“花板"，就是空白、陰陽性對照及室內質控孔結果正常，而標本孔的OD值卻偏高。之所以空白、對照及質控結果正常而標本孔異常，是因為樣品本身的原因，大部分或全部標本孔的OD值偏高，很可能是因為樣品中某些共有的物質非特異性的吸附于固相載體，而在實驗的過程中未被除去。
1、待測血清中混有紅細胞或纖維蛋白原 這兩種物質易沉淀或附著在聚乙烯孔內不易洗凈，李文，卓瑪等人［1,2］實驗表明在較高的離心轉速(3000 /min)和較長的離心時間(>10 min)之下，血液標本被充分地離心分離之后，使紅細胞和纖維蛋白充分沉淀，可以在加樣時避免加入紅細胞和纖維蛋白，避免這兩種干擾物質對實驗結果的影響，就可避免“花板"情況。
   2、 高IgG血癥 在實際工作中，筆者發現，檢測丙肝的實驗出現花板的情況較多，原因之一是因為目前國內外的抗-HCV EIA試劑均采用間接酶聯免疫檢測原理，間接法的一個重要影響因素是血清中所含的高濃度的非特異性IgG，IgG對聚苯乙烯有較強的吸附力，非特異性IgG可吸附到固相載體上或包被的抗原上造成假陽性。
　

二、 解決辦法主要在洗滌
聚苯乙烯因其具有較強的吸附蛋白質的性能而被廣泛用于ELISA實驗的固相載體，聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，因此需要通過洗滌清除在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。洗滌在 ELISA 過程中雖不是一個反應步驟，但卻決定著實驗的成敗。上述提到的血清中存在紅細胞或纖維蛋白原，可以在加樣前離心時得到控制，同樣也可以通過適當增加洗滌次數和浸泡時間減輕或避免對實驗結果的影響，同樣，對于血液存在的非特異性的IgG,實驗者很難在加樣時將其去除，那么解決的最佳時機就是洗滌過程。

   ELISA在洗滌過程中需注意以下幾點：

1、板(ban)(ban)要(yao)平整，尤(you)其(qi)是(shi)在用(yong)洗(xi)(xi)板(ban)(ban)機(ji)洗(xi)(xi)板(ban)(ban)的過程中，往(wang)往(wang)是(shi)3排一起洗(xi)(xi)，如(ru)果板(ban)(ban)不平，就很可(ke)能造成洗(xi)(xi)液有殘留，從而導致非特(te)異性結合不能清(qing)除干(gan)凈，對(dui)實驗結果造成干(gan)擾(rao)。

2、洗(xi)液(ye)(ye)溫(wen)度(du)，實驗表明(ming)，洗(xi)液(ye)(ye)溫(wen)度(du)也會影響(xiang)洗(xi)板(ban)的干凈程度(du)，尤其是(shi)冬天溫(wen)度(du)過低時容易出(chu)現“花板(ban)"問題(ti)。因此，最好保(bao)持室溫(wen)在20℃-30℃。

3、洗液要注滿孔，孔壁(bi)洗滌不干(gan)凈(jing)也易造(zao)成“花(hua)板"現象。

4、洗(xi)液要(yao)新鮮配(pei)置(zhi)，洗(xi)液要(yao)臨(lin)用(yong)前新鮮配(pei)制，放置(zhi)時間過長(chang)易產生(sheng)絮狀物(wu)或混濁(zhuo)，造成賭孔或花板。

5、洗板次數不(bu)夠(gou)或洗滌間隔時(shi)間過短也會造(zao)成由于洗板不(bu)凈而造(zao)成“花板"。

三、 孵育時間過長也會造成“花板"
本實驗室曾有一段時間經常出現丙肝檢測“花板"現象，究其原因是由于樣本較多，加樣后未及時放入孵育箱，反應板在室溫呆的時間過長，即間接增加了孵育時間，導致孵育時間過長，蛋白質非特異性吸附于固相載體。因此，應嚴格控制加樣時間，加樣后及時孵育，標本較多時可分批操作。
此外，有些的試劑顯色液不穩定，使用前容易變藍，如在實驗前不仔細檢查，很容易導致“花板"現象的發生，這也提醒實驗者應使用新鮮的顯色液，很大程度的保證實驗的準確性。

 　  綜上所述，將ELISA“花(hua)板(ban)(ban)(ban)(ban)"現象總結為：花(hua)板(ban)(ban)(ban)(ban)原因大多在(zai)樣(yang)品(pin)，解決辦法主要在(zai)洗滌，孵(fu)育和顯色(se)過(guo)(guo)程也(ye)會導致。既然原因大多在(zai)樣(yang)品(pin)，那么在(zai)樣(yang)品(pin)交接時應嚴(yan)(yan)格按(an)照規定，無(wu)(wu)溶(rong)血，無(wu)(wu)凝血，足量，單個的溶(rong)血樣(yang)品(pin)雖(sui)不(bu)致造成“花(hua)板(ban)(ban)(ban)(ban)"，但血紅蛋白中(zhong)(zhong)的血紅素基團(tuan)，具有類過(guo)(guo)氧化物的活性，在(zai)以(yi)辣根過(guo)(guo)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)為標記酶的ELISA測(ce)定中(zhong)(zhong)，易在(zai)孵(fu)育過(guo)(guo)程中(zhong)(zhong)吸附于固相，從而與后面加(jia)入的底物反應顯色(se)，從而造成假陽性。洗滌是(shi)ELISA的關鍵步驟，充(chong)分(fen)有效(xiao)的洗滌也(ye)是(shi)避(bi)免“花(hua)板(ban)(ban)(ban)(ban)"的有利措(cuo)施。同樣(yang)，嚴(yan)(yan)格按(an)照試劑說明孵(fu)育，使用新鮮的顯色(se)液(ye)也(ye)是(shi)有效(xiao)避(bi)免“花(hua)板(ban)(ban)(ban)(ban)"的保障(zhang)。以(yi)上措(cuo)施可以(yi)有效(xiao)減少“花(hua)板(ban)(ban)(ban)(ban)"次數，從而提(ti)高檢(jian)測(ce)的特異性和準確性，更好(hao)的發揮(hui)ELISA的方(fang)法學優勢。