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小腸結腸炎耶爾森菌探針法熒光定量PCR試劑盒
小腸結腸炎耶爾森菌探針法熒光定量PCR試劑盒
商品描述:
商品屬性
商品描述:
商品屬性
本產(chan)品僅供科研使用(yong)(yong).請勿用(yong)(yong)于醫藥,不(bu)能用(yong)(yong)于臨床治療診斷使用(yong)(yong)!
產品屬性:
產品名稱 規格 貨號 小腸結腸炎耶爾森菌探針法熒光定量PCR試劑盒 50T BJ-P10229
實驗所需但試劑盒未包含材料:
1、1.5ml 無菌低吸附離心管
2、 96 孔 qPCR 板
3、 一次性手套
4、 1000ul 、100ul 、10ul 無菌低吸附帶濾芯移液槍頭
相關設備:
1、離心機
2、渦旋振蕩器
3、熒光定量 PCR 儀
4、 1000ul 、100ul 、10ul 移液器
特點:1. 即開即用,用戶只需要提供樣品 DNA 模板。2. 引物和探針經過優化,靈敏性高。3. 提供陽性對照,便于區分假陰性樣品。4. 特異性高,引物是根據巴西副球孢子菌高度保守區設計,不會跟其他病毒 DNA 發生交叉反應。5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。6. 本產品只能用于科研。
規格及成分:
編號 成分 規格 試劑一 2×Probe qPCR MagicMix 500 μL(本色蓋) 試劑二 熒光PCR專用模板稀釋液 1 mL(黃蓋) 試劑三 巴西副球孢子菌qPCR引物混合液 100 μL(白蓋) 試劑四 巴西副球孢子菌qPCR探針 50 μL(棕色管) 試劑五 巴西副球孢子菌探針法qPCR陽性對照(1×10E8拷貝/μL) 50 μL(紅蓋)
小腸結腸炎耶爾森菌探針法熒光定量PCR試劑盒使用方法:
一、稀釋標準曲線樣品
(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)。由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原,本產品不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 如果有 N 個樣品,最好設置 N+2 個提取,多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照),一個是 NC(樣品制備陰性對照)。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數 DNA 提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR 反應(20μL 體系,在樣品制備室進行)
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復,則標記 N+9 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),6個用于標準曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復,則標記 N+4 個 PCR管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),1 個用于 PCR 陽性對照(用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列(lie)出一(yi)次重復(fu)。樣品管和陰性(xing)對(dui)照設置(zhi)完畢后(hou)才設置(zhi)陽性(xing)對(dui)照,并且(qie)陽性(xing)對(dui)照樣品要等所有管子(zi)蓋上蓋子(zi)儲(chu)存好(hao)后(hou)最后(hou)加):
成份 N+2 個樣品管 PCR 陰性對照管 標準曲線樣品管(2-7管) 2×Probe qPCR MagicMix 10μL 10μL 各10μL 巴西副球孢子菌qPCR探針 1μL 1μL 各1μL 巴西副球孢子菌探針法qPCR引物混合液 2μL 2μL 各2μL N+2個待測DNA模板
7μL-- -- 超純水 -- 7μL -- 第7步所得標準曲線樣品稀釋液(2-7號) -- -- 各7μL(2號樣到2號管,3號樣到3號管…) 11. 蓋上蓋子后上機,按下面參數進行 PCR:
過程 溫度 時間 預變性 95℃ 3 min PCR 反應(40 個循環) 95℃ 15 sec 60℃ 1 min(采集FAM通道的熒光信號) 12. 如果把本試劑(ji)盒(he)用于定量檢(jian)測(ce)(ce),則以陽性對照濃(nong)度的(de) log 值(zhi)為橫軸(zhou)(zhou),以 Ct 值(zhi)為縱(zong)軸(zhou)(zhou),繪制標(biao)準(zhun)曲線(xian)。再以待測(ce)(ce)樣品(pin)的(de) Ct 值(zhi)從標(biao)準(zhun)曲線(xian)上推(tui)算出樣品(pin) RNA濃(nong)度的(de) log 值(zhi),再推(tui)算出其濃(nong)度。
小腸結腸炎耶爾森菌探針法熒光定量PCR試劑盒四、數據處理
13. 如(ru)果把本試劑盒用(yong)于(yu)(yu)定性(xing)(xing)檢(jian)測(ce),只(zhi)判斷陽性(xing)(xing)或陰(yin)(yin)性(xing)(xing),則(ze)(ze)陰(yin)(yin)性(xing)(xing)對照 Ct 必須(xu)大(da)于(yu)(yu)或等于(yu)(yu) 40。陽性(xing)(xing)對照必須(xu)有(you)熒光對數增(zeng)長,有(you)典型(xing)擴增(zeng)曲線(xian),Ct 值應該(gai)小(xiao)于(yu)(yu)或等于(yu)(yu) 30。對待測(ce)樣品,如(ru)果其 Ct 大(da)于(yu)(yu)或等于(yu)(yu) 40 則(ze)(ze)為(wei)陰(yin)(yin)性(xing)(xing),如(ru)果小(xiao)于(yu)(yu)或等于(yu)(yu) 35 則(ze)(ze)為(wei)陽性(xing)(xing)。如(ru)果在 35-40 之間,則(ze)(ze)重復一次(ci)。若重復結果 Ct值小(xiao)于(yu)(yu) 40,擴增(zeng)曲線(xian)有(you)明(ming)顯起峰,該(gai)樣本判斷為(wei)陽性(xing)(xing),否則(ze)(ze)為(wei)陰(yin)(yin)性(xing)(xing)。
