本產品僅供科研(yan)使(shi)用(yong).請勿(wu)用(yong)于醫藥,不能用(yong)于臨床治療診斷使(shi)用(yong)！

產品屬性：

產品名稱	規格	貨號
柑橘黃龍病菌亞洲種探針法熒光定量PCR試劑盒	50T	BJ-P10238

實驗所需但試劑盒未包含材料：
1、1.5ml 無菌低吸附離心管
2、 96 孔 qPCR 板
3、 一次性手套
4、 1000ul 、100ul 、10ul 無菌低吸附帶濾芯移液槍頭
相關設備：
1、離心機
2、渦旋振蕩器
3、熒光定量 PCR 儀
4、 1000ul 、100ul 、10ul 移液器
特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經過優化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據巴西副球孢子菌高度保守區設計，不會跟其他病毒 DNA 發

生交叉反應。

5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。

6. 本產品只能用于科研。
規格及成分：

編號	成分	規格
試劑一	2×Probe qPCR MagicMix	500 μL（本色蓋）
試劑二	熒光PCR專用模板稀釋液	1 mL（黃蓋）
試劑三	巴西副球孢子菌qPCR引物混合液	100 μL（白蓋）
試劑四	巴西副球孢子菌qPCR探針	50 μL（棕色管）
試劑五	巴西副球孢子菌探針法qPCR陽性對照(1×10E8拷貝/μL)	50 μL（紅蓋）

柑橘黃龍病菌亞洲種探針法熒光定量PCR試劑盒使用方法：
一、稀釋標準曲線樣品
（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備
7. 如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數 DNA 提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管(guan)中按下(xia)表加入各(ge)成分(fen)（本(ben)表只列出一(yi)次重復(fu)。樣(yang)品管(guan)和陰性(xing)對(dui)照設置完畢(bi)后(hou)才設置陽性(xing)對(dui)照，并(bing)且(qie)陽性(xing)對(dui)照樣(yang)品要(yao)等所有管(guan)子蓋上(shang)蓋子儲存好后(hou)最后(hou)加）：

成份	N+2 個樣品管	PCR 陰性對照管	標準曲線樣品管（2-7管）
2×Probe qPCR MagicMix	10μL	10μL	各10μL
巴西副球孢子菌qPCR探針	1μL	1μL	各1μL
巴西副球孢子菌探針法qPCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
N+2個待測DNA模板	7μL	--	--
超純水	--	7μL	--
第7步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7號）	--	--	各7μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…）

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR：

過程	溫度	時間
預變性	95℃	3 min
PCR 反應（40 個循環）	95℃	15 sec
60℃	1 min（采集FAM通道的熒光信號）

12. 如果把(ba)本(ben)試劑盒用于定量檢測，則以(yi)陽性對照濃度(du)的(de) log 值為橫(heng)軸，以(yi) Ct 值為縱軸，繪制標(biao)準(zhun)曲線(xian)。再以(yi)待測樣品(pin)的(de) Ct 值從標(biao)準(zhun)曲線(xian)上推算(suan)出(chu)樣品(pin) RNA濃度(du)的(de) log 值，再推算(suan)出(chu)其濃度(du)。

柑橘黃龍病菌亞洲種探針法熒光定量PCR試劑盒四、數據處理

13. 如(ru)(ru)果把本試劑(ji)盒用于定性(xing)(xing)檢測，只判斷(duan)陽(yang)性(xing)(xing)或(huo)陰(yin)性(xing)(xing)，則(ze)(ze)(ze)陰(yin)性(xing)(xing)對照(zhao) Ct 必須(xu)(xu)大(da)于或(huo)等(deng)(deng)于 40。陽(yang)性(xing)(xing)對照(zhao)必須(xu)(xu)有熒光對數(shu)增長，有典(dian)型擴增曲線，Ct 值應(ying)該小于或(huo)等(deng)(deng)于 30。對待(dai)測樣(yang)品，如(ru)(ru)果其 Ct 大(da)于或(huo)等(deng)(deng)于 40 則(ze)(ze)(ze)為陰(yin)性(xing)(xing)，如(ru)(ru)果小于或(huo)等(deng)(deng)于 35 則(ze)(ze)(ze)為陽(yang)性(xing)(xing)。如(ru)(ru)果在 35-40 之間，則(ze)(ze)(ze)重復一次。若重復結(jie)果 Ct值小于 40，擴增曲線有明(ming)顯起(qi)峰(feng)，該樣(yang)本判斷(duan)為陽(yang)性(xing)(xing)，否則(ze)(ze)(ze)為陰(yin)性(xing)(xing)。