
商品描述:
商品屬性
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特點優勢:
1. 特異性:所有產品使用的引物均經過詳盡的生物信息學分析,經過GenBank及自建龐大數據庫的比對,確保所用的每一條引物均為種屬或血清型特異的基因序列區段,可實現對xi 菌種屬及血清型的特異檢測,特異性均達到佳 。
2. 重(zhong)現(xian)性(xing):該系列所(suo)有產品均(jun)經過大(da)量實驗菌株的驗證(zheng),重(zhong)現(xian)性(xing)為佳 。
3. 靈敏(min)性:該系(xi)列產品可實現對檢測(ce)菌(jun)的高靈敏(min)檢測(ce),當樣品中xi 菌(jun)的濃度達到103cfu/ml時(shi),可實現對其的直接檢測(ce),無需繁瑣的增菌(jun)過程。
4. 實用性(xing):檢(jian)測(ce)范(fan)圍廣,涵蓋了(le)對(dui)人體危(wei)害(hai)較(jiao)為嚴(yan)重的(de)17種呼吸道(dao)(dao)及(ji)腸道(dao)(dao)致病(bing)菌,可(ke)實現對(dui)臨床(chuang)樣品及(ji)其他環境取樣的(de)快(kuai)速檢(jian)測(ce),整個檢(jian)測(ce)過程為3-4個小時。
5. 優(you)勢1:序列資(zi)源豐富(fu),除GenBank公布的(de)序列外,公司還進行了大量(liang)菌(jun)株(zhu)的(de)序列破譯,從理論上保(bao)證所選引物具有良好的(de)保(bao)守性(xing)和特異(yi)性(xing)。
6. 優勢(shi)2:該系列試劑盒(he)均經過大量的(de)(de)保守性(xing)(xing)及特異(yi)(yi)性(xing)(xing)實驗(yan)(yan)驗(yan)(yan)證(zheng),憑借公司擁有的(de)(de)豐富的(de)(de)菌(jun)(jun)種(zhong)資源(yuan),每一(yi)種(zhong)檢測試劑盒(he)均經過了20余(yu)種(zhong)標(biao)準菌(jun)(jun)株(zhu)和臨床菌(jun)(jun)株(zhu)的(de)(de)保守性(xing)(xing)驗(yan)(yan)證(zheng)及40余(yu)種(zhong)近緣標(biao)準菌(jun)(jun)株(zhu)和臨床菌(jun)(jun)株(zhu)的(de)(de)特異(yi)(yi)性(xing)(xing)驗(yan)(yan)證(zheng),確(que)保在使(shi)用過程中不會出現(xian)任何的(de)(de)假(jia)陽性(xing)(xing)及假(jia)陰(yin)性(xing)(xing)報告(gao)結(jie)果(guo)。
RNA和DNA提取:
裂解:裂解公式可能因您要提取 DNA 還是 RNA 而異,但共同點是含有高濃度離液鹽的裂解緩沖液。
Chaotropes(離液劑(ji))的(de)作用(yong):Chaotrope會破壞氫(qing)鍵及疏水(shui)間的(de)相互(hu)作用(yong)。離液鹽包括鹽酸(suan)胍、硫qing酸(suan)胍、尿(niao)素和高lv酸(suan)鋰。
洗滌劑:除了離液劑外,裂解緩沖液中通常還有一些去污劑,以幫助蛋白質溶解和裂解。
溶jun酶和蛋白酶K:根據樣品類型,也可以使用酶進行裂解。
提取步驟:
1.從負(fu)八(ba)十(shi)冰箱取出樣(yang)品,放置于冰上(shang)緩(huan)慢解凍; (提前(qian)預冷離心(xin)機(ji)至4度)
2.待(dai)解凍后(紅色),加(jia)入200 μl氯(lv)仿(加(jia)入lv仿體積為(wei)Trizol體積的1/5),劇烈(lie)震(zhen)蕩(乳(ru)白紅色),冰上靜(jing)置(zhi)10 min。 (氯(lv)仿為(wei)有機(ji)溶劑,有效的使有機(ji)相(xiang)和(he)(he)無機(ji)相(xiang)迅速(su)分離(li)。有機(ji)相(xiang)中主(zhu)要是酚和(he)(he)蛋(dan)白結合(he),從而使得蛋(dan)白和(he)(he)RNA脫離(li),RNA進入水相(xiang)。)
3.放置于(yu)預冷離心機,離心(4度(du),12000 rpm,15 min),離心后(hou)可見明顯分三層(ceng)(上(shang)層(ceng)無色(se)透(tou)明水相為(wei)(wei)RNA層(ceng),中間(jian)很薄的乳白色(se)為(wei)(wei)DNA層(ceng),下層(ceng)為(wei)(wei)紅色(se)為(wei)(wei)蛋白層(ceng))。
4.小心緩慢吸(xi)取(qu)上(shang)清,約400 μl(寧可少(shao)吸(xi),也不(bu)要多吸(xi)取(qu)),置(zhi)(zhi)于另一個新的(de)1.5 ml RNase-free EP管(guan)中,加入等體積的(de)異丙醇,上(shang)下顛倒混(hun)勻,常溫靜(jing)置(zhi)(zhi)放置(zhi)(zhi)15 min。
5.離心(4度,12000 rpm,15 min),可見白(bai)色沉(chen)淀(dian)(有時(shi)細胞較(jiao)少看不到沉(chen)淀(dian),可放置負二(er)十(shi)或(huo)負八十(shi)兩小時(shi)再繼續后面步驟)
6.棄上清,每管加入950 ul 75% 乙醇,上下(xia)顛(dian)倒(dao)混勻(yun)(切記不要用槍吹打混勻(yun),這樣(yang)會造成RNA溶解(jie))。
7.離心(xin)(4度,12000 rpm,10 min),可見底部明顯(xian)白色沉淀。
8.離心(xin)后,棄掉上清,放入離心(xin)機再次瞬離,用10 μl 的移(yi)液器洗去殘留液體(ti), 開蓋晾干(約5 min)。
9.每個樣品根據沉淀(dian)大(da)小加入適量DEPC水(一(yi)般20~30 μl,有(you)時看不(bu)到沉淀(dian),可加10 μl DEPC水溶解),吹(chui)打溶解RNA,十一(yi)樓酶標儀測濃度,OD值(260/280=1.8-2.0)標記,負八十保存。
備注:對于中性粒細胞提取RNA建議細胞數目大于2x106/樣品;
備注:操作過程中佩戴口罩。
PCR反應五要(yao)素(su):
參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物: 引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列,就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。設計引物應(ying)遵(zun)循以下原則:
①引物長度: 15-30bp,常(chang)用為20bp左右。
②引物(wu)擴(kuo)增(zeng)跨度: 以200-500bp為宜(yi),特(te)定條件下可擴(kuo)增(zeng)長(chang)至10kb的片段。
③引物堿基:G+C含(han)量(liang)以(yi)40-60%為宜,G+C太少擴(kuo)增效(xiao)果不佳,G+C過(guo)多(duo)易出(chu)現非特(te)異條(tiao)帶。ATGC好隨機分布,避(bi)免5個以(yi)上的嘌呤或嘧啶(ding)核(he)苷酸的成串(chuan)排(pai)列。
④避免引物(wu)內部出現二級結(jie)構,避免兩條引物(wu)間互補,特(te)別是3’端的互補,否則(ze)會形成引物(wu)二聚體(ti),產生非特(te)異的擴增條帶。
⑤引物3’端的堿(jian)基,特(te)別是(shi) 末及(ji)倒數 個堿(jian)基,應(ying)嚴格要求配對,以避免因末端堿(jian)基不配對而導致PCR失(shi)敗。
⑥引物中有或能(neng)加上合適(shi)的酶切位點,被擴(kuo)增的靶序(xu)列 有適(shi)宜的酶切位點,這對(dui)酶切分析(xi)或分子(zi)克隆(long)很有好處(chu)。
⑦引物的(de)特(te)異性:引物應與核酸序列數據庫的(de)其它序列無明(ming)顯同源性。注意事項:
1.試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,板條應裝入密封袋中保存。濃洗滌液可能會有結晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結果。
2.各步(bu)加(jia)樣均應使(shi)用加(jia)樣器,并經常(chang)校對(dui)其(qi)準確性,以避免試驗誤差。一次加(jia)樣時間控制(zhi)在(zai)5分鐘內,如標本數量多,推(tui)薦(jian)使(shi)用排(pai)槍(qiang)加(jia)樣。
3.請(qing)每次(ci)測定的同時(shi)做標準(zhun)曲線(xian),做復孔(kong)。如標本中待測物質含量過高(樣本OD值大于標準(zhun)品(pin)(pin)孔(kong)di一孔(kong)的OD值),請(qing)先(xian)用(yong)樣品(pin)(pin)稀釋液稀釋一定倍數(shu)(n倍)后(hou)再測定,計算時(shi)請(qing)再乘以總稀釋倍數(shu)(×n×5)。
4.封板膜只限一次性使用,以(yi)避免交叉(cha)污染。
5.底(di)物請避光(guang)保存。
6.嚴格按照(zhao)說(shuo)明書的(de)操作進行,試驗結(jie)果判定必須以酶標儀(yi)讀數為準(zhun).
7.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物(wu)都應(ying)按傳染物(wu)處(chu)理。
8.本試劑不同(tong)批號(hao)組分不得混用。
9.不能使(shi)用過期產品。
10. 如與(yu)英(ying)文說明書有(you)異(yi),以英(ying)文說明書為準(zhun)。
