EASYspin 全血 RNA 快速提取試劑盒 (DNase I )

商品屬性：

產品名(ming)稱	規格	貨號
EASYspin 全血 RNA 快速提取試劑盒 (DNase I )	50 次	BJ-PJ6325

商品介(jie)紹：
保存條件：本試劑盒在規(gui)定保存(cun)溫(wen)度儲(chu)存(cun) 12 個月不影響(xiang)使用效果。
產品介紹：
紅細胞(bao)(bao)裂(lie)解液(ye)(ye)(ye)選(xuan)擇性裂(lie)解紅細胞(bao)(bao),然后獨特的裂(lie)解液(ye)(ye)(ye)/β-巰基(ji)乙(yi)醇(chun)迅速裂(lie)解白(bai)(bai)細胞(bao)(bao) 和(he)滅活(huo)細胞(bao)(bao) RNA 酶(mei)，然后用乙(yi)醇(chun)調節結合條件(jian)后，RNA 在(zai)高離(li)序鹽狀態下選(xuan)擇性吸 附于離(li)心柱內硅(gui)基(ji)質(zhi)膜(mo)，再通(tong)過一系列快速的漂(piao)洗(xi)－離(li)心的步驟, 去蛋(dan)白(bai)(bai)液(ye)(ye)(ye)和(he)漂(piao)洗(xi)液(ye)(ye)(ye) 將(jiang)細胞(bao)(bao)代(dai)謝物，蛋(dan)白(bai)(bai)等雜質(zhi)去除，最后低鹽的 RNase free H2O 將(jiang) RNA 從硅(gui)基(ji)質(zhi)膜(mo)上洗(xi) 脫。
自備試劑：乙(yi)醇，β-巰(qiu)基乙(yi)醇
注意事項：
1.第一(yi)次(ci)使(shi)用前請先在(zai)漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中(zhong)加(jia)入指定量乙醇，加(jia)入后請及時(shi)打(da)鉤標記已(yi)加(jia)入乙醇，以免(mian)多次(ci)加(jia)入!
2.需要自備一次性注射器。
3.裂解液(ye)RLT和去蛋白液(ye)RW1中含有刺激性化合物，操作時要戴乳膠手套，避免沾染(ran)皮膚(fu)，眼睛(jing)和衣服。若沾染(ran)皮膚(fu)、眼睛(jing)時，要用(yong)大量(liang)清水(shui)或者生理鹽水(shui)沖洗。
4.關于DNA的微量殘留(liu)：
由于(yu)采取了(le)本公司獨特(te)的(de)緩(huan)沖體(ti)系和選擇了(le)特(te)殊吸附能力的(de)吸附膜，在大(da)多數RT-PCR 擴增(zeng)過(guo)程中極其微量(liang)的(de) DNA 殘留（一般(ban)電泳 EB 染(ran)色紫外(wai)燈下觀(guan)察不(bu)可見(jian)）影響不(bu)是很大(da)，如(ru)果要進行嚴(yan)格的(de) mRNA 表達量(liang)分析如(ru)熒光定量(liang) PCR，我們建議(yi)在進
行模板和引物的選擇時：
⑴選用(yong)跨內含子(zi)的引物，這樣 DNA 就不能作(zuo)為模(mo)板參與擴增反應(ying)。
⑵選擇基因組 DNA 和 cDNA 上擴(kuo)增的產物大小不(bu)一樣的引物對。
5.RNA 純度(du)及濃(nong)度(du)檢(jian)測：
完(wan)整性：RNA 可用普(pu)通瓊脂糖凝膠電泳 (電泳條件：膠濃度 1.2%；0.5×TBE 電泳緩(huan)沖液；150V，15 min)檢測完(wan)整性。由于(yu)細胞(bao)中(zhong) 70%-80%的(de) RNA 為(wei) rRNA，電泳后 UV下應(ying)(ying)能看到非常明顯的(de) rRNA 條帶(dai)。動物(wu)(wu) rRNA 大(da)小分別(bie)約為(wei) 5 kb 和(he) 2 kb，分別(bie)相(xiang)當于(yu) 28S 和(he) 18S rRNA。動物(wu)(wu) RNA 樣品(pin)中(zhong)最(zui)大(da) rRNA 亮度應(ying)(ying)為(wei)次大(da) rRNA 亮度的(de) 1.5-2.0倍，否則表示(shi) RNA 樣品(pin)的(de)降解。出現彌散片狀(zhuang)或條帶(dai)消失表明樣品(pin)嚴(yan)重降解。
純度(du)：OD260/OD280 比(bi)值(zhi)是(shi)衡量(liang)蛋白質污染程度(du)的(de)指標。高質量(liang)的(de) RNA，OD260/OD280 讀(du)數(shu)（10 mMTris, pH7.5）在 1.8-2.1 之間(jian)(jian)。OD260/OD280 讀(du)數(shu)受測定(ding)所用溶(rong)液(ye)的(de) pH 值(zhi)影響。同一個(ge) RNA 樣品，假(jia)定(ding)在 10 mM Tris，pH7.5 溶(rong)液(ye)中測出的(de) OD260/OD280 讀(du)數(shu)1.8-2.1 之間(jian)(jian)，在水溶(rong)液(ye)中所測讀(du)數(shu)則可能在 1.5-1.9 之間(jian)(jian)，但這并不(bu)(bu)表示(shi) RNA 不(bu)(bu)純。
濃度(du)：取(qu)一定(ding)量的 RNA 提取(qu)物，用 RNase-free 水稀釋 n 倍，用 RNase-free 水將分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計調零，取(qu)稀釋液進行 OD260，OD280測定(ding)，按照以下公式(shi)進行 RNA 濃度(du)的計算：
終濃(nong)度（ng/μl）= (OD260)×(稀釋倍數(shu) n)×40
操作步驟：
? 使用前將(jiang) 10×RLB（RNase-free）用 DEPC 處理水稀釋到 1×。
? 操作前(qian)在裂解液 RLT 中加(jia)(jia)入β-巰基乙醇(chun)(chun)至終濃度 1%，如 1 ml RLT 中加(jia)(jia)入 10 μl β- 巰基乙醇(chun)(chun)。此裂解液最好現用現配。配好的 RLT 4℃可放置一個月。
1.在(zai)適合大(da)小的(de)RNase free離心管(guan)中加(jia)入(ru)1體積（<1.5 ml）加(jia)入(ru)各種(zhong)抗凝劑新鮮血液 (顛倒(dao)混(hun)勻后)和 3 體積的(de) 1×RLB（RNase free），顛倒(dao)混(hun)勻，可輕彈管(guan)壁,確保混(hun)勻。
2.室溫放(fang)置 10 min（期間應(ying)該顛倒輕彈(dan)混勻(yun)數(shu)次幫助(zhu)裂(lie)解紅細胞）。如果(guo) RNA 降解嚴(yan)重,可(ke)在冰上裂(lie)解,但是時間可(ke)長一些以充分裂(lie)解。
3.12,000 rpm 離心 20 sec，倒棄紅(hong)(hong)色上(shang)清，并(bing)小(xiao)心的盡可能多的吸棄上(shang)清（注意不要吸到管底(di)的細(xi)胞團），留下完(wan)整的管底(di)白細(xi)胞團。如發現紅(hong)(hong)細(xi)胞大(da)量殘留可重復 2，3 步驟(zou)。
4.渦(wo)旋或(huo)者輕(qing)彈管壁將白細胞沉淀(dian)完(wan)全松散重懸(xuan)，加 350 μl（<0.5 ml 全血或(huo)<2×10 6白 細胞）或(huo)者 600 μl（0.5-1.5 ml 全血或(huo) 2×10 6-1&times;10 7 白細胞）裂解液(ye) RLT，吹打混(hun)勻 后用手劇(ju)烈振蕩 20 sec，充分裂解。
5.用帶鈍針(zhen)頭的一次性(xing) 1 ml(配(pei) 0.9 mm 針(zhen)頭) 注射器抽打(da)裂(lie)解物 5-10 次或直(zhi)到(dao)得(de)到(dao)滿 意勻漿(jiang)結果(或者電動(dong)勻漿(jiang) 30 sec)，可(ke)以剪切 DNA，降低粘稠(chou)度和提高(gao)產量。
6.較精(jing)確估計裂解物(wu)體(ti)積，加入(ru)等體(ti)積的 70%乙醇（請先檢查(cha)是(shi)否已加入(ru)無水(shui)乙醇!）， 此時可能(neng)出現沉淀(dian)，但是(shi)不影響(xiang)提取(qu)過程，立(li)即吹打(da)混(hun)勻(yun)，不要(yao)離心。
7.將混(hun)合(he)物(每次小于(yu) 700 μl，多可(ke)以分兩次加入)加入一個吸(xi)(xi)附柱 RA 中（吸(xi)(xi)附柱放入 收集管中），12,000 rpm 離心(xin) 30-60 sec，棄掉廢液。
8.加 350 μl 去蛋白液(ye) RW1，室(shi)溫放(fang)置 30 sec，12,000 rpm 離心 30 sec，棄掉廢液(ye)。將吸 附柱 RA 放(fang)回收集管中(zhong)。
9.DNase I 工作液(ye)的配制：取(qu) 10 μl DNase I 儲存液(ye)放(fang)入新的 RNase-free 離心管中，加入 70 μl RDD 溶液(ye)，輕柔混勻(yun)。
10.向吸(xi)附柱 RA 中央加入 80 μl DNase I 工作液，室(shi)溫放置(zhi) 15 min（一般情(qing)況下室(shi)溫放 置(zhi)可(ke)得到(dao)較好(hao)的消化效果，如果室(shi)溫效果不(bu)佳可(ke)選擇在 37℃放置(zhi) 15 min）。
11.加 350 μl 去蛋白液(ye) RW1，室(shi)溫(wen)放(fang)置 30 sec，12,000 rpm 離心 30 sec，棄(qi)掉廢(fei)液(ye)。將(jiang) 吸附柱 RA 放(fang)回收集管中。
12.加入 500 μl 漂洗液 RW（請先(xian)檢查是否已加入無(wu)水乙醇!），12,000 rpm 離心 30 sec， 棄掉(diao)廢液。加入 500 μl 漂洗液 RW，重復一遍。
13.將吸(xi)附(fu)柱 RA 放回(hui)空收(shou)集管中(zhong)，12,000 rpm 離心(xin) 2 min，將吸(xi)附(fu)柱置于室(shi)溫放置數分 鐘(zhong)，以徹(che)底晾(liang)干吸(xi)附(fu)材料中(zhong)殘余的漂洗液。