pBM26 Toposmart Cloning Kit（gateway系統入門 TOPO克隆載體）

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產品名稱	規格	貨號
pBM26 Toposmart Cloning Kit（gateway系統入門 TOPO克隆載體）	20 次	BJ-PJ6526

商品介紹：

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產品介紹：
利用(yong)痘苗病毒的(de)(de)(de)拓撲(pu)異構酶(mei)I(Topoisomerase I)的(de)(de)(de)切割再連接的(de)(de)(de)特(te)點將PCR產物定向克隆到線性(xing)化(hua)的(de)(de)(de)pBM26載(zai)體(ti)中。適用(yong)于(yu)克隆由Pfu、sPfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶(mei)擴增的(de)(de)(de)平末端PCR產物。pBM26載(zai)體(ti)類似于(yu)invitrogen公司(si)的(de)(de)(de)pENTR/D-TOPO入(ru)門載(zai)體(ti)，具有attL1和attL2，為gateway系統中的(de)(de)(de)入(ru)門載(zai)體(ti)。引物M13F(-21)r和M13R可(ke)用(yong)于(yu)菌落PCR和測序(xu)鑒定。
產品特點：
(1) 連接(jie)反應僅需 5 分鐘(zhong)。
(2) 只適合平末端(duan) PCR 產物的快(kuai)速(su)、高效(xiao)、定向(xiang)克(ke)隆。
(3) 載體采用了新的制備(bei)工藝(yi)，零背景(jing)，無需藍白斑篩選
(4) 可(ke)在基因的 C 端中融合 Flag 標簽序(xu)列(lie)。
(5) 載體為卡那霉素抗性。
注意事項：
(1) 引物(wu)要求：PCR 引物(wu) 5’端不能(neng)進(jin)行(xing)磷酸化修飾，普通(tong)商業化引物(wu)即(ji)可(ke)。上游引物(wu)的(de)(de)(de)(de) 5’端添加 CACC 四個堿基(ji)（CACC 為真核表達(da)所(suo)必(bi)需(xu)的(de)(de)(de)(de)Kozak 序列）。如果(guo)目的(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白需(xu)要在 C 端帶(dai) FLAG 標(biao)簽(qian)，下游引物(wu)則需(xu)要去掉基(ji)因本身的(de)(de)(de)(de)終止密(mi)碼子(zi)(zi)（3 個堿基(ji)），目的(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白的(de)(de)(de)(de)翻譯終止由 FLAG 標(biao)簽(qian)的(de)(de)(de)(de)終止密(mi)碼子(zi)(zi) TAA（位于(yu) Xho I 酶切位點前）來實現。
(2) DNA 聚(ju)合酶：選用 Pfu、sPfu、Phusion、Q5、KOD 和(he) Xerox 等高保真 DNA 聚(ju)合酶用于 PCR 擴增(zeng)。
(3)連接(jie)時間：5-15 分鐘，一般為 15 分鐘。
(4)連接溫度：室(shi)溫 (22℃-30℃)，可使用PCR儀控溫。最佳反應(ying)溫度為(wei)25℃。若片段有高GC等復雜結(jie)構，可在37℃反應(ying)。
(5)產(chan)物(wu)(wu)(wu)要求：為(wei)保證PCR產(chan)物(wu)(wu)(wu)完整，建(jian)議72℃后(hou)延伸5-10分鐘。連(lian)(lian)接(jie)(jie)前(qian)使用瓊(qiong)脂糖凝(ning)膠電泳檢(jian)測PCR產(chan)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)質量和(he)純度，如(ru)PCR產(chan)物(wu)(wu)(wu)為(wei)非(fei)單(dan)一(yi)性條(tiao)帶，目的(de)(de)片段一(yi)定要切膠回收。如(ru)PCR產(chan)物(wu)(wu)(wu)為(wei)單(dan)一(yi)條(tiao)帶，無引物(wu)(wu)(wu)二(er)聚體，可以取(qu)1-3?l的(de)(de)PCR產(chan)物(wu)(wu)(wu)直(zhi)接(jie)(jie)連(lian)(lian)接(jie)(jie)。但若擴增(zeng)(zeng)模板(ban)為(wei)質粒(li)(li)DNA，應注意質粒(li)(li)的(de)(de)抗(kang)性。由于pBM26載體為(wei)卡那抗(kang)性，以氨芐抗(kang)性的(de)(de)模板(ban)質粒(li)(li)擴增(zeng)(zeng)的(de)(de)PCR產(chan)物(wu)(wu)(wu)直(zhi)接(jie)(jie)連(lian)(lian)接(jie)(jie)后(hou)的(de)(de)產(chan)物(wu)(wu)(wu)可涂布在卡那抗(kang)性的(de)(de)LB平板(ban)上。以卡那抗(kang)性的(de)(de)模板(ban)質粒(li)(li)擴增(zeng)(zeng)的(de)(de)PCR產(chan)物(wu)(wu)(wu)應切膠回收后(hou)再連(lian)(lian)接(jie)(jie)。
(6)片段(duan)(duan)用(yong)(yong)量：膠回收的DNA片段(duan)(duan)一(yi)般使用(yong)(yong)量為(wei)50-100ng。對照(zhao)片段(duan)(duan)為(wei)5’端(duan)帶(dai)CACC四個堿(jian)基(ji)(ji)的全(quan)長(chang)EGFP基(ji)(ji)因的平末端(duan)產物(wu)。
(7)在M13F(-21)和M13R引物干粉管(guan)中加120?l滅菌(jun)水即為5?M濃(nong)度的引物。