pBM26 Toposmart Cloning Kit（gateway系統入門 TOPO克隆載體）

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產品(pin)名稱	規格	貨號
pBM26 Toposmart Cloning Kit（gateway系統入門 TOPO克隆載體）	20 次	BJ-PJ6526

商(shang)品介紹：

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產品介紹：
利(li)用痘苗病毒的(de)拓撲異構(gou)酶I(Topoisomerase I)的(de)切(qie)割再連接的(de)特點將PCR產(chan)物(wu)定(ding)向克隆(long)到(dao)線性化的(de)pBM26載(zai)(zai)體(ti)中(zhong)。適(shi)用于(yu)克隆(long)由(you)Pfu、sPfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶擴增的(de)平末端(duan)PCR產(chan)物(wu)。pBM26載(zai)(zai)體(ti)類似于(yu)invitrogen公司的(de)pENTR/D-TOPO入門(men)載(zai)(zai)體(ti)，具有attL1和attL2，為gateway系統中(zhong)的(de)入門(men)載(zai)(zai)體(ti)。引物(wu)M13F(-21)r和M13R可用于(yu)菌落PCR和測序鑒定(ding)。
產品特點：
(1) 連接反應僅需 5 分鐘(zhong)。
(2) 只適合平末端 PCR 產物(wu)的快速、高效(xiao)、定向克(ke)隆(long)。
(3) 載體采用了新的制(zhi)備工藝，零(ling)背景，無(wu)需藍白(bai)斑篩選
(4) 可在基因(yin)的(de) C 端中融(rong)合 Flag 標簽序(xu)列(lie)。
(5) 載體為卡那霉素抗性。
注意事項：
(1) 引(yin)(yin)(yin)物(wu)要(yao)求：PCR 引(yin)(yin)(yin)物(wu) 5’端(duan)(duan)不能進行(xing)磷酸化修(xiu)飾，普通商業化引(yin)(yin)(yin)物(wu)即可。上游引(yin)(yin)(yin)物(wu)的(de)(de) 5’端(duan)(duan)添加(jia) CACC 四個堿(jian)基(ji)（CACC 為真(zhen)核(he)表達所必(bi)需(xu)(xu)的(de)(de)Kozak 序列）。如果目(mu)的(de)(de)蛋白需(xu)(xu)要(yao)在(zai) C 端(duan)(duan)帶(dai) FLAG 標簽，下游引(yin)(yin)(yin)物(wu)則需(xu)(xu)要(yao)去掉基(ji)因本身的(de)(de)終(zhong)止(zhi)密(mi)碼(ma)子(zi)（3 個堿(jian)基(ji)），目(mu)的(de)(de)蛋白的(de)(de)翻譯終(zhong)止(zhi)由 FLAG 標簽的(de)(de)終(zhong)止(zhi)密(mi)碼(ma)子(zi) TAA（位(wei)于 Xho I 酶切位(wei)點前）來實現。
(2) DNA 聚(ju)合(he)酶：選用 Pfu、sPfu、Phusion、Q5、KOD 和 Xerox 等高(gao)保(bao)真 DNA 聚(ju)合(he)酶用于(yu) PCR 擴增。
(3)連接(jie)時(shi)間：5-15 分鐘，一般為 15 分鐘。
(4)連接(jie)溫(wen)度：室溫(wen) (22℃-30℃)，可使用PCR儀(yi)控溫(wen)。最佳(jia)反應溫(wen)度為25℃。若片段有高GC等復雜結構(gou)，可在37℃反應。
(5)產(chan)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)要求：為(wei)(wei)保(bao)證PCR產(chan)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)完整，建議72℃后(hou)(hou)延伸5-10分(fen)鐘。連接(jie)前使(shi)用瓊脂糖凝(ning)膠(jiao)電泳(yong)檢測PCR產(chan)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)質量和(he)純度，如PCR產(chan)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)為(wei)(wei)非(fei)單(dan)一性(xing)條帶，目的(de)(de)(de)片段一定(ding)要切(qie)(qie)膠(jiao)回收。如PCR產(chan)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)為(wei)(wei)單(dan)一條帶，無引物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)二聚體，可(ke)以取(qu)1-3?l的(de)(de)(de)PCR產(chan)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)直(zhi)接(jie)連接(jie)。但若擴增(zeng)模板為(wei)(wei)質粒(li)DNA，應(ying)注意質粒(li)的(de)(de)(de)抗(kang)(kang)性(xing)。由于pBM26載體為(wei)(wei)卡那(nei)抗(kang)(kang)性(xing)，以氨(an)芐抗(kang)(kang)性(xing)的(de)(de)(de)模板質粒(li)擴增(zeng)的(de)(de)(de)PCR產(chan)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)直(zhi)接(jie)連接(jie)后(hou)(hou)的(de)(de)(de)產(chan)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)可(ke)涂布在卡那(nei)抗(kang)(kang)性(xing)的(de)(de)(de)LB平板上(shang)。以卡那(nei)抗(kang)(kang)性(xing)的(de)(de)(de)模板質粒(li)擴增(zeng)的(de)(de)(de)PCR產(chan)物(wu)(wu)(wu)(wu)(wu)應(ying)切(qie)(qie)膠(jiao)回收后(hou)(hou)再連接(jie)。
(6)片(pian)段用(yong)量：膠(jiao)回收的DNA片(pian)段一般使用(yong)量為50-100ng。對(dui)照片(pian)段為5’端(duan)帶CACC四(si)個堿基的全(quan)長EGFP基因(yin)的平末(mo)端(duan)產物。
(7)在M13F(-21)和M13R引物(wu)干粉管中(zhong)加120?l滅菌水即(ji)為5?M濃度的引物(wu)。