pCold-SUMO-10His原核蛋白表達試劑盒

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pCold-SUMO-10His原核蛋白表達試劑盒	1 kit	BJ-PJ6666

商品介(jie)紹：

描(miao)述：本試劑(ji)盒(he)所包含(han)的原核表達(da)載體(pCold-SUMO-10His)是(shi)在 pCold-SUMO 載體基礎上改(gai)造而成( 專利)，

該載體啟動子(CS Promoter)來源于南極嗜冷細菌，在低溫下(15 度)才能啟動蛋白的表達。低溫下細菌生長緩慢，使得蛋白合成速度減慢，從而最大限度的提高了蛋白正確折疊的幾率，提高了蛋白可溶性表達，增強了活性蛋白的表達比率。該表達系統所包含的 SUMO tag 可以極大地提高小分子量蛋白的表達量，而且進一步提高了蛋白的可溶表達幾率。同時，TEE 信號肽可增強冷啟動子調控下目的蛋白的高表達。
改進后(hou)的(de)(de) pCold-SUMO-10His 載體，其 SUMO 蛋白(bai)標簽(qian)含有 10 個(ge)組(zu)氨酸標簽(qian)（10His tag），使其結(jie)合(he)(he) Ni-NTA 的(de)(de)能(neng)(neng)力(li)更強。與(yu)較早版本的(de)(de) pCold-SUMO 表達系(xi)統(tong)相比，pCold-SUMO-10His 表達系(xi)統(tong)在保留了原(yuan)有統(tong)的(de)(de)蛋白(bai)可溶性(xing)能(neng)(neng)生產能(neng)(neng)力(li)、高特異(yi)性(xing)剪切能(neng)(neng)力(li)的(de)(de)情況下，對(dui) Ni-NTA 結(jie)合(he)(he)能(neng)(neng)力(li)的(de)(de)得到明顯提高。其對(dui) Ni-NTA 結(jie)合(he)(he)能(neng)(neng)力(li)的(de)(de)提高，

在以下(xia)三個方面改善了生(sheng)產重(zhong)組蛋白的性能：

（1）提(ti)高了粗蛋白(bai)樣品(pin)中目標蛋白(bai)的捕獲能力，從而(er)提(ti)高純(chun)化(hua)產(chan)量(liang)；

（2）在蛋白純化過程中可以
使用更(geng)高濃(nong)度的(de)咪唑進(jin)行漂洗，去雜(za)蛋白的(de)能(neng)力明(ming)顯提(ti)升，從而獲(huo)得(de)更(geng)高純度的(de)重組蛋白；

（3）在重組蛋白酶切去除 SUMO標簽后，利用 Ni-NTA 去除 SUMO 標簽更為徹底，獲得純度更高的無標簽目標蛋白。
關于宿主菌的使用：本試劑盒配備了兩種宿主表達菌感受態細胞，Lyophilized Arctic (DE3)感受態和 LyophilizedBL21(DE3) Chaprone 感受態，兩種感受態均為凍干品形式可長期保存在-20℃，效價無明顯下降（2~10X10e5 cfu/μg）。
通(tong)常在質(zhi)粒(li)載(zai)體(ti)的(de)構(gou)建(jian)完(wan)成，并測序驗證后，可將重組質(zhi)粒(li)轉(zhuan)入該(gai)感受(shou)態(tai)進行(xing)蛋(dan)(dan)白表(biao)(biao)達。該(gai)宿主菌僅為蛋(dan)(dan)白表(biao)(biao)達生產用，不可以(yi)進行(xing)載(zai)體(ti)構(gou)建(jian)和(he)質(zhi)粒(li)的(de)提取制備(bei)。由于(yu) pCold-SUMO 系統的(de)高可溶性表(biao)(biao)達特(te)性，在大多(duo)數情(qing)況(kuang)下重組蛋(dan)(dan)白在 LyophilizedArctic (DE3)感受(shou)態(tai)即可獲得理想(xiang)的(de)可溶表(biao)(biao)達，因(yin)此首次實驗請選用 Lyophilized Arctic (DE3)感受(shou)態(tai)宿主菌。

在 LyophilizedArctic (DE3)感受態宿主菌可溶表達效果不理想的情況下，再選用操作相對復雜的、帶有輔助折疊伴侶分子的 LyophilizedBL21(DE3)Chaprone 宿主菌，該系統可獲得最佳的可溶表達。除此外，pCold-SUMO 系統在常規 BL21(DE3)、BL21(DE3)plys等宿主菌內均可獲得可觀的可溶性表達。
關于蛋白酶的使用：試劑盒配備了 SUMO 蛋白酶（酵母來源，也稱為 UIP 蛋白酶）和 rTEV 蛋白酶，在第一步載體構建過程中需要評估、考慮兩個蛋白酶的使用策略。SUMO 蛋白酶識別蛋白結構，切割活性高、酶切完全，對于需要去除 Tag的重組蛋白其是首選。個別情況下 SUMO 標簽的結構會受到 C 端重組目標蛋白的影響，使得 SUMO 蛋白酶對重組融合蛋白的切割效率降低、甚至是無效，此時再選用 rTEV 蛋白酶進行酶切。由于 rTEV 蛋白酶識別氨基酸序列，個別重組融合蛋白會包埋識別序列，因此也會導致蛋白酶切效率下降。由于重組融合蛋白結構的無法預測性，因此在實驗過程中兩種蛋白酶的酶切均需要測試。無論如何，通常 SUMO 蛋白酶具有更高的效率，是首選。本試劑盒配備的 SUMO 蛋白酶可以識別 SUMO標簽結構（SDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG）切割位點位于 QIGG 之后。SUMO 蛋白酶含有雙 His 標簽，保證了 SUMO 蛋白酶高親力的結合 Ni-NTA，以最大限度的去除 SUMO 蛋白酶（分子量約 26kD）。rTEV 蛋白酶可以識別 SUMO 標簽后面的 Glu-AsnLeu-Tyr-Phe-Gln-Gly (ENLYFQG)氨基酸序列，并在識別位點 Gln-Gly(QG)之間進行切割，從而去除 SUMO 標簽。rTEV 蛋白酶含有 6XHis 標簽（分子量約 30kD），可使用 Ni-NTA 純化介質去除。
本試劑盒配備的 pCold-SUMO-10His-Positive Plasmid 為蛋(dan)白(bai)表達(da)(da)(da)陽(yang)性(xing)質粒(li)，該質粒(li)含(han)有 43kD 的目(mu)標蛋(dan)白(bai)，其與SUMO 標簽（19kD）融合后分子(zi)量約(yue)為 62kD。該表達(da)(da)(da)質粒(li)在 Arctic (DE3)中即可(ke)獲(huo)得良好的表達(da)(da)(da)。其可(ke)以僅(jin)可(ke)做為表達(da)(da)(da)、酶切實驗的陽(yang)性(xing)對照品(pin)。