組織細胞microRNA提取試劑盒

商品屬性：

產品(pin)名稱(cheng)	規格(ge)	貨(huo)號
組織細胞microRNA提取試劑盒	25T	BJ-PJ6635
組織細胞microRNA提取試劑盒	100T	BJ-PJ6635

商品介(jie)紹：

描述(shu)：生產(chan)的(de)(de)組(zu)(zu)織(zhi)細胞 miRNA 提(ti)取(qu)(qu)試劑(ji)盒是目前世界 上(shang)提(ti)取(qu)(qu)小 RNA（<200nt）操(cao)作步(bu)(bu)驟最簡單、重復性(xing)最好(hao)、 小 RNA 產(chan)率最高(gao)(gao)的(de)(de)方法。使(shi)用(yong)該試劑(ji)盒提(ti)取(qu)(qu)的(de)(de)小 RNA （Small RNA）中，長度在 15～200nt 范圍(wei)的(de)(de) RNA 在 95% 以(yi)上(shang)，基本(ben)不(bu)含有大 RNA 和 DNA。使(shi)用(yong)該試劑(ji)通過一步(bu)(bu)上(shang) 柱即可(ke)(ke)獲得高(gao)(gao)純(chun)度 miRNA，可(ke)(ke)在 45min 內完成小 RNA 的(de)(de)提(ti) 取(qu)(qu)。該試劑(ji)盒廣泛(fan)適用(yong)于動(dong)物組(zu)(zu)織(zhi)、細胞和多糖多酚(fen)含量不(bu) 高(gao)(gao)的(de)(de)植物組(zu)(zu)織(zhi)樣本(ben)。

儲存：室(shi)溫可保存 2 年。

使用(yong)防護建議(yi)：miRNA Reagent A 溶液中含有(you)胍鹽，其具有(you) 強烈的腐蝕性，試驗時請務(wu)必(bi)佩戴防護眼鏡、手套、口(kou)罩等(deng) 防護措(cuo)施(shi)，如有(you)皮(pi)膚接觸請立(li)即用(yong)大量清水沖洗(xi)，再另(ling)行就 醫。

操(cao)作方法： 1. 組(zu)(zu)織(zhi)樣本提(ti)取(qu) (1) 向 1.5ml EP 管中(zhong)(zhong)(zhong)加(jia)入(ru)(ru) 300μl miRNA Reagent A。植物組(zu)(zu) 織(zhi)則再加(jia)入(ru)(ru) 10μl β-巰基乙(yi)醇(chun)，混合均(jun)(jun)勻。 (2) 在液氮條(tiao)件(jian)下(xia)充分(fen)將組(zu)(zu)織(zhi)研(yan)(yan)磨(mo)粉碎，將一定的(de)(de)樣品量（見(jian) 樣本使用(yong)(yong)量表）研(yan)(yan)磨(mo)成粉狀(zhuang)(zhuang)的(de)(de)組(zu)(zu)織(zhi)加(jia)入(ru)(ru)到(dao)(dao)上(shang)(shang)(shang)述(shu) 300μl miRNA Reagent A 中(zhong)(zhong)(zhong)，立即手腕用(yong)(yong)力(li)震(zhen)蕩至(zhi)組(zu)(zu)織(zhi)粉末(mo)徹底溶解(jie)于裂(lie) 解(jie)液中(zhong)(zhong)(zhong)。室(shi)溫靜置 5min 以充分(fen)裂(lie)解(jie)細胞。 注意：將組(zu)(zu)織(zhi)加(jia)入(ru)(ru)到(dao)(dao) miRNA Reagent A 后要迅(xun)速將組(zu)(zu)織(zhi)震(zhen)散，否 則易引(yin)起組(zu)(zu)織(zhi)成團狀(zhuang)(zhuang)，不容易裂(lie)解(jie)。如發生成團狀(zhuang)(zhuang)，務必用(yong)(yong)移(yi)液器 將團狀(zhuang)(zhuang)組(zu)(zu)織(zhi)吹打(da)松散。 (3) 向上(shang)(shang)(shang)述(shu)裂(lie)解(jie)完(wan)畢(bi)的(de)(de)裂(lie)解(jie)液中(zhong)(zhong)(zhong)加(jia)入(ru)(ru) 350μl miRNA Reagent B，上(shang)(shang)(shang)下(xia)顛倒(dao)(dao)混合均(jun)(jun)勻。13,000rpm 離(li)(li)心(xin)(xin)(xin) 5min，吸(xi)(xi)取(qu) 550μl 上(shang)(shang)(shang)清(qing)液，轉(zhuan)移(yi)到(dao)(dao)新(xin)的(de)(de) 1.5ml EP 管中(zhong)(zhong)(zhong)。 (4) 向上(shang)(shang)(shang)述(shu)溶液中(zhong)(zhong)(zhong)加(jia)入(ru)(ru) 200μl 無水(shui)乙(yi)醇(chun)，手腕用(yong)(yong)力(li)震(zhen)蕩數次(ci)(ci)， 室(shi)溫放置 5min。 (5) 13,000rpm 離(li)(li)心(xin)(xin)(xin) 10min，轉(zhuan)移(yi) 700μl 上(shang)(shang)(shang)清(qing)液到(dao)(dao)新(xin)的(de)(de) 1.5ml EP 管中(zhong)(zhong)(zhong)。 (6) 向上(shang)(shang)(shang)述(shu)溶液中(zhong)(zhong)(zhong)加(jia)入(ru)(ru) 300μl 異(yi)丙醇(chun)，手腕用(yong)(yong)力(li)上(shang)(shang)(shang)下(xia)顛倒(dao)(dao)數 次(ci)(ci)。 (7) 分(fen)兩次(ci)(ci)將上(shang)(shang)(shang)述(shu)溶液倒(dao)(dao)入(ru)(ru)到(dao)(dao) miRNA 吸(xi)(xi)附(fu)柱(zhu)中(zhong)(zhong)(zhong)，13,000rpm 離(li)(li)心(xin)(xin)(xin) 1min，倒(dao)(dao)掉過(guo)濾(lv)液。 (8) 向吸(xi)(xi)附(fu)柱(zhu)中(zhong)(zhong)(zhong)加(jia)入(ru)(ru)700μl 75%異(yi)丙醇(chun)洗滌(di)一次(ci)(ci)，13,000rpm 離(li)(li)心(xin)(xin)(xin) 1min，倒(dao)(dao)掉過(guo)濾(lv)液。 (9) 向吸(xi)(xi)附(fu)柱(zhu)中(zhong)(zhong)(zhong)加(jia)入(ru)(ru) 500μl 無水(shui)乙(yi)醇(chun)洗滌(di)一次(ci)(ci)，13,000rpm 離(li)(li)心(xin)(xin)(xin) 1min，倒(dao)(dao)掉過(guo)濾(lv)液。 (10) 吸(xi)(xi)附(fu)柱(zhu) 13,000rpm 空離(li)(li)心(xin)(xin)(xin) 2min，去掉殘留的(de)(de)乙(yi)醇(chun)。 (11) 將吸(xi)(xi)附(fu)柱(zhu)放入(ru)(ru)到(dao)(dao)新(xin) 1.5ml EP 管中(zhong)(zhong)(zhong)，室(shi)溫放置 2min，使 殘留乙(yi)醇(chun)揮發。在吸(xi)(xi)附(fu)柱(zhu)濾(lv)芯上(shang)(shang)(shang)加(jia)入(ru)(ru) 30μl RnaseFree TE Buffer，室(shi)溫靜置 2min，13,000rpm 離(li)(li)心(xin)(xin)(xin) 2min，洗脫產物 即為提(ti)取(qu)的(de)(de) miRNA。（通常(chang)取(qu) 1～2μl 該(gai)產物，即可使用(yong)(yong) 一步法 miRNA 反轉(zhuan)錄試劑盒進行反轉(zhuan)錄反應(ying)，

2. 細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)樣本提取 (1) 貼壁細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)：胰(yi)酶消化細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)后，離(li)心(xin)收集細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)沉(chen)淀(dian)。用(yong) 100μl 1×PBS 重懸細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)后，加(jia)入(ru) 300μl miRNA Reagent A 顛倒(dao)混(hun) 合均勻，室(shi)溫放(fang)置 5min。 (2) 懸浮細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)：直接離(li)心(xin)后，收集細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)沉(chen)淀(dian)。用(yong) 100μl 1×PBS 重懸細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)后，加(jia)入(ru) 300μl miRNA Reagent A 顛倒(dao)混(hun)合均勻， 室(shi)溫放(fang)置 5min。 (3) 向(xiang)(xiang)上述裂解(jie)完(wan)畢的(de)裂解(jie)液(ye)(ye)中加(jia)入(ru) 250μl miRNA Reagent B，上下(xia)顛倒(dao)混(hun)合均勻。13,000rpm 離(li)心(xin) 5min，吸(xi)取 550μl 上清液(ye)(ye)，轉(zhuan)(zhuan)移(yi)到(dao)新的(de) 1.5ml EP 管(guan)中。 注(zhu)意：加(jia)入(ru)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)體積數與 miRNA Reagent B 總體積數為 350μl。如(ru)加(jia)入(ru) 50μl細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)，則 miRNA Reagent B使(shi)用(yong) 300μl。 (4) 向(xiang)(xiang)上述 550μl 上清溶液(ye)(ye)中加(jia)入(ru) 200μl 無水(shui)乙(yi)醇(chun)(chun)，手腕用(yong) 力(li)震蕩(dang)數次(ci)，室(shi)溫放(fang)置 5min。 (5) 13,000rpm 離(li)心(xin) 10min，轉(zhuan)(zhuan)移(yi) 700μl 上清液(ye)(ye)到(dao)新的(de) 1.5ml EP 管(guan)中。 (6) 向(xiang)(xiang)上述溶液(ye)(ye)中加(jia)入(ru) 300μl 異丙醇(chun)(chun)，手腕用(yong)力(li)上下(xia)顛倒(dao)數 次(ci)。 (7) 分(fen)兩(liang)次(ci)將上述溶液(ye)(ye)倒(dao)入(ru)到(dao) miRNA 吸(xi)附(fu)柱(zhu)中，13,000rpm 離(li)心(xin) 1min，倒(dao)掉過濾液(ye)(ye)。 (8) 向(xiang)(xiang)吸(xi)附(fu)柱(zhu)中加(jia)入(ru)700μl 75%異丙醇(chun)(chun)洗滌一(yi)次(ci)，13,000rpm 離(li)心(xin) 1min，倒(dao)掉過濾液(ye)(ye)。 (9) 向(xiang)(xiang)吸(xi)附(fu)柱(zhu)中加(jia)入(ru) 500μl 無水(shui)乙(yi)醇(chun)(chun)洗滌一(yi)次(ci)，13,000rpm 離(li)心(xin) 1min，倒(dao)掉過濾液(ye)(ye)。 (10) 吸(xi)附(fu)柱(zhu) 13,000rpm 空離(li)心(xin) 2min，去(qu)掉殘留的(de)乙(yi)醇(chun)(chun)。 (11) 將吸(xi)附(fu)柱(zhu)放(fang)入(ru)到(dao)新 1.5ml EP 管(guan)中，室(shi)溫放(fang)置 2min，使(shi) 殘留乙(yi)醇(chun)(chun)揮發。在吸(xi)附(fu)柱(zhu)濾芯(xin)上加(jia)入(ru) 30μl RnaseFree TE Buffer，室(shi)溫靜置 2min，13,000rpm 離(li)心(xin) 2min，洗脫產物 即(ji)(ji)為提取的(de) miRNA。（通常取 1～2μl 該產物，即(ji)(ji)可使(shi)用(yong) 一(yi)步法 miRNA 反(fan)轉(zhuan)(zhuan)錄試劑盒進(jin)行反(fan)轉(zhuan)(zhuan)錄反(fan)應，。

常見問題匯總(zong)： (1) 本(ben)方法提取(qu)(qu)的(de)(de)小(xiao) RNA，95％以(yi)上為小(xiao) RNA（200nt 的(de)(de) RNA，通(tong)常殘留的(de)(de)>200nt RNA 不(bu)影(ying)響后續試(shi)(shi)驗(yan)(yan)操作。 (2) 本(ben)試(shi)(shi)劑盒提取(qu)(qu)的(de)(de)小(xiao) RNA 由于不(bu)含 mRNA 等大分子(zi)量的(de)(de) RNA，因此更(geng)適(shi)合做后續反(fan)轉(zhuan)錄試(shi)(shi)驗(yan)(yan)，從而進行(xing)定(ding)量試(shi)(shi)驗(yan)(yan)。 (3) 使用(yong)本(ben)試(shi)(shi)劑盒提取(qu)(qu)的(de)(de) miRNA 濃度通(tong)常在 50ng/μl 左右， 取(qu)(qu) 5～10μl 即可用(yong)于電泳檢測。取(qu)(qu) 1~2μl 即可用(yong)于 HG TaqMan miRNA 反(fan)轉(zhuan)錄試(shi)(shi)劑盒進行(xing)反(fan)轉(zhuan)錄反(fan)應，