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細胞凍存實驗步驟及注意事項

  細胞培養的傳代及日常維持過程中,在培養器具、培養液及各種準備工作方面都需大量的耗費,而且細胞一旦離開活體開始原代培養,它的各種生物特性都將逐漸發生變化并隨著傳代次數的增加和體外環境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時進行細胞凍存十分必要。細胞冷凍儲存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;細胞儲存在液氮中,溫度達-196℃,理論上儲存時間是無限的。

實驗步驟:
1. 制備凍存液,凍存液比例:本實(shi)驗(yan)室采用70%基(ji)礎培養(yang)基(ji)+20%FBS+10%DMSO,不(bu)同實(shi)驗(yan)室及(ji)不(bu)同細胞可(ke)能略有差異,也可(ke)采用55%基(ji)礎培養(yang)基(ji)+40%FBS+5%DMSO;

2. 取形態(tai)良好(hao),處(chu)于對數生長期的細胞,對其消化、離心(xin) (1500rpm離心(xin)8min)、計數;

3. 根據細胞(bao)數(shu)量加入對(dui)應的凍(dong)存液,使細胞(bao)密度維持在(zai)300-500w/mL;

4. 小(xiao)心用(yong)鑷子(zi)打開凍(dong)存管(guan)(guan)管(guan)(guan)蓋,每管(guan)(guan)分裝1-1.5mL含(han)細(xi)胞的(de)凍(dong)存液(ye),擰(ning)緊蓋管(guan)(guan),做好(hao)標記。

5. 分(fen)裝好的凍存(cun)管(guan)轉入程(cheng)序降溫盒(he)后直接放-80℃過夜;

6. 若沒有程序降(jiang)溫盒,則按下列順(shun)序依次降(jiang)溫:室溫→4℃20min→-20℃30min→-80℃過夜(ye),注意轉移(yi)過程中要(yao)保(bao)冷,避免產(chan)生溫差或(huo)凍存(cun)管融化;

7. 從-80℃冰箱取出凍存管迅速轉移到液氮(dan)長期保存。

注意事項:

1. 為(wei)保持細胞最大存(cun)活(huo)率,一般都采用慢(man)凍存(cun)融(rong)的方法(fa)。

2. 凍存物(wu)距液氮(dan)面越近溫(wen)度(du)越低。標準的低凍速度(du)為-1℃~12℃/分鐘,當溫(wen)度(du)下降達(da)-25℃時,下降速度(du)可增至-5~-10℃/分鐘,到-100℃時則可迅速凍入(ru)液氮(dan)中。因此要適當掌(zhang)握凍存物(wu)下降入(ru)液氮(dan)中的速度(du),過快能(neng)影響細胞內水分透出,太慢(man)則促(cu)冰晶形成。

3. 初次凍(dong)(dong)存(cun)(cun)者在(zai)下(xia)降凍(dong)(dong)存(cun)(cun)時(shi),宜先用(yong)細木棒伸入罐中(zhong)探測液(ye)面位(wei)置,然后需用(yong)溫(wen)度(du)計與(yu)凍(dong)(dong)存(cun)(cun)物并行的辦法(fa),以觀測下(xia)降凍(dong)(dong)存(cun)(cun)物的速度(du)、凍(dong)(dong)存(cun)(cun)物與(yu)液(ye)氮(dan)液(ye)面距離和(he)溫(wen)度(du)三者關系,當(dang)已掌握以上各(ge)參數(shu)和(he)凍(dong)(dong)存(cun)(cun)技術熟練后,僅按下(xia)降時(shi)間和(he)下(xia)降距離便可獲理想凍(dong)(dong)存(cun)(cun)效果(guo)。

4. 各種細(xi)胞(bao)對凍存(cun)速度的要求也不一樣(yang);上皮細(xi)胞(bao)和成纖維(wei)細(xi)胞(bao)耐受性可(ke)能大些,骨(gu)髓干細(xi)胞(bao)-2~-3℃/分(fen)鐘合適;胚胎(tai)細(xi)胞(bao)耐受性較(jiao)小,不宜太快(kuai)。總之在一開始時,下降速度不能超過(guo)-10℃/分(fen)鐘。

5. 用(yong)什么(me)防護劑合(he)適和(he)用(yong)量(liang)多大(da),要依細(xi)(xi)胞(bao)而(er)定,初代培(pei)養細(xi)(xi)胞(bao)用(yong)DMSO 較(jiao)好,一般細(xi)(xi)胞(bao)可用(yong)甘油;用(yong)量(liang)以(yi)較(jiao)小(xiao)為(wei)好。有人認為(wei)人皮(pi)膚上皮(pi)細(xi)(xi)胞(bao)貯存(cun)在20%-30%甘油中很(hen)好。

6. 原則上(shang)細胞在液氮中可貯(zhu)存(cun)多年,但為妥善起(qi)見(jian),凍存(cun)一年后,應(ying)再復(fu)蘇培養一次,然后再繼(ji)續凍存(cun)。

7. 將凍存管(guan)放(fang)入液(ye)氮容器或從中取(qu)出時,要做好防護(hu)工作,以免凍傷

8. 注意自身的(de)安全(quan),對于來(lai)自人(ren)源(yuan)性(xing)(xing)或病毒感(gan)染的(de)細胞株應(ying)特別小心。操(cao)作(zuo)過(guo)程(cheng)中,應(ying)避免引起(qi)氣溶(rong)膠的(de)產生,小心有毒性(xing)(xing)試劑(ji)例如DMSO,并避免尖銳物品傷人(ren)等。

 

 

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