實驗步驟：
1. 制備(bei)凍存(cun)液，凍存(cun)液比例：本實驗室采(cai)用70%基(ji)(ji)礎(chu)培養(yang)基(ji)(ji)+20%FBS+10%DMSO，不同實驗室及不同細胞可能略有差異(yi)，也可采(cai)用55%基(ji)(ji)礎(chu)培養(yang)基(ji)(ji)+40%FBS+5%DMSO；

2. 取形態良(liang)好，處(chu)于(yu)對數生(sheng)長期的細胞(bao)，對其消化、離心 (1500rpm離心8min)、計數；

3. 根據細胞數量加入對(dui)應的凍存(cun)液，使(shi)細胞密(mi)度維持在(zai)300-500w/mL；

4. 小心用鑷子打開凍存(cun)管管蓋(gai)，每管分裝1-1.5mL含細胞的(de)凍存(cun)液，擰緊蓋(gai)管，做好標記。

5. 分裝好的凍(dong)存管轉(zhuan)入程序降溫盒(he)后(hou)直接放-80℃過夜；

6. 若沒有(you)程序降溫(wen)盒(he)，則按下列順序依次降溫(wen)：室溫(wen)→4℃20min→-20℃30min→-80℃過(guo)夜(ye)，注意轉移過(guo)程中要保冷，避免(mian)產生溫(wen)差或凍存(cun)管融(rong)化；

7. 從-80℃冰箱(xiang)取出凍存管迅速(su)轉移(yi)到(dao)液氮長(chang)期保存。

注意事項：

1. 為保持(chi)細胞最大(da)存(cun)活率，一般都采(cai)用慢凍存(cun)融的方法。

2. 凍存物(wu)距液氮面越近溫(wen)(wen)度(du)越低(di)。標準的低(di)凍速度(du)為(wei)－1℃~12℃/分鐘，當溫(wen)(wen)度(du)下降(jiang)達－25℃時，下降(jiang)速度(du)可(ke)增至－5~－10℃/分鐘，到－100℃時則可(ke)迅速凍入液氮中(zhong)。因此要適當掌握凍存物(wu)下降(jiang)入液氮中(zhong)的速度(du)，過快能影(ying)響(xiang)細胞內水分透出(chu)，太慢則促冰晶(jing)形成。

3. 初次凍(dong)(dong)存(cun)者在下降(jiang)凍(dong)(dong)存(cun)時(shi)，宜先用(yong)細木棒(bang)伸入罐中探測(ce)液(ye)面(mian)位置(zhi)，然(ran)后需用(yong)溫度(du)計與凍(dong)(dong)存(cun)物并行的辦(ban)法，以觀測(ce)下降(jiang)凍(dong)(dong)存(cun)物的速(su)度(du)、凍(dong)(dong)存(cun)物與液(ye)氮液(ye)面(mian)距離(li)和溫度(du)三(san)者關系(xi)，當已掌(zhang)握以上各參數和凍(dong)(dong)存(cun)技術熟練后，僅按下降(jiang)時(shi)間和下降(jiang)距離(li)便(bian)可獲理想凍(dong)(dong)存(cun)效(xiao)果。

4. 各種細(xi)(xi)胞(bao)對凍存速(su)度(du)的要求(qiu)也不一樣；上(shang)皮細(xi)(xi)胞(bao)和成纖維細(xi)(xi)胞(bao)耐受性可能大些(xie)，骨髓干細(xi)(xi)胞(bao)－2~－3℃/分(fen)鐘合(he)適；胚胎細(xi)(xi)胞(bao)耐受性較小，不宜太快。總之在一開始(shi)時，下降速(su)度(du)不能超(chao)過－10℃/分(fen)鐘。

5. 用(yong)什么防(fang)護劑合適和用(yong)量多大，要依細胞而定，初代培(pei)養(yang)細胞用(yong)DMSO 較(jiao)好，一般細胞可用(yong)甘油；用(yong)量以較(jiao)小為(wei)(wei)好。有人認為(wei)(wei)人皮(pi)膚上皮(pi)細胞貯存在20%-30%甘油中很好。

6. 原則上細胞在液氮中可(ke)貯存多年，但為妥善起見，凍存一年后，應(ying)再復(fu)蘇培養(yang)一次，然后再繼(ji)續凍存。

7. 將(jiang)凍存管(guan)放入(ru)液氮(dan)容器或從中取出(chu)時(shi)，要(yao)做好防護工作，以免凍傷

8. 注意(yi)自(zi)身(shen)的(de)安(an)全，對于來自(zi)人源性或(huo)病毒感染(ran)的(de)細胞株應(ying)特(te)別(bie)小(xiao)心(xin)。操(cao)作過(guo)程中，應(ying)避免(mian)引起(qi)氣(qi)溶膠的(de)產生，小(xiao)心(xin)有毒性試劑例如DMSO，并避免(mian)尖(jian)銳物品傷人等。