實驗步驟：
1. 制備凍存液，凍存液比例：本實(shi)驗(yan)室采用70%基(ji)礎培養(yang)基(ji)+20%FBS+10%DMSO，不(bu)同實(shi)驗(yan)室及(ji)不(bu)同細胞可(ke)能略有差異，也可(ke)采用55%基(ji)礎培養(yang)基(ji)+40%FBS+5%DMSO；

2. 取形態(tai)良好(hao)，處(chu)于對數生長期的細胞，對其消化、離心(xin) (1500rpm離心(xin)8min)、計數；

3. 根據細胞(bao)數(shu)量加入對(dui)應的凍(dong)存液，使細胞(bao)密度維持在(zai)300-500w/mL；

4. 小(xiao)心用(yong)鑷子(zi)打開凍(dong)存管(guan)(guan)管(guan)(guan)蓋，每管(guan)(guan)分裝1-1.5mL含(han)細(xi)胞的(de)凍(dong)存液(ye)，擰(ning)緊蓋管(guan)(guan)，做好(hao)標記。

5. 分(fen)裝好的凍存(cun)管(guan)轉入程(cheng)序降溫盒(he)后直接放-80℃過夜；

6. 若沒有程序降(jiang)溫盒，則按下列順(shun)序依次降(jiang)溫：室溫→4℃20min→-20℃30min→-80℃過夜(ye)，注意轉移(yi)過程中要(yao)保(bao)冷，避免產(chan)生溫差或(huo)凍存(cun)管融化；

7. 從-80℃冰箱取出凍存管迅速轉移到液氮(dan)長期保存。

注意事項：

1. 為(wei)保持細胞最大存(cun)活(huo)率，一般都采用慢(man)凍存(cun)融(rong)的方法(fa)。

2. 凍存物(wu)距液氮(dan)面越近溫(wen)度(du)越低。標準的低凍速度(du)為－1℃~12℃/分鐘，當溫(wen)度(du)下降達(da)－25℃時，下降速度(du)可增至－5~－10℃/分鐘，到－100℃時則可迅速凍入(ru)液氮(dan)中。因此要適當掌(zhang)握凍存物(wu)下降入(ru)液氮(dan)中的速度(du)，過快能(neng)影響細胞內水分透出，太慢(man)則促(cu)冰晶形成。

3. 初次凍(dong)(dong)存(cun)(cun)者在(zai)下(xia)降凍(dong)(dong)存(cun)(cun)時(shi)，宜先用(yong)細木棒伸入罐中(zhong)探測液(ye)面位(wei)置，然后需用(yong)溫(wen)度(du)計與(yu)凍(dong)(dong)存(cun)(cun)物并行的辦法(fa)，以觀測下(xia)降凍(dong)(dong)存(cun)(cun)物的速度(du)、凍(dong)(dong)存(cun)(cun)物與(yu)液(ye)氮(dan)液(ye)面距離和(he)溫(wen)度(du)三者關系，當(dang)已掌握以上各(ge)參數(shu)和(he)凍(dong)(dong)存(cun)(cun)技術熟練后，僅按下(xia)降時(shi)間和(he)下(xia)降距離便可獲理想凍(dong)(dong)存(cun)(cun)效果(guo)。

4. 各種細(xi)胞(bao)對凍存(cun)速度的要求也不一樣(yang)；上皮細(xi)胞(bao)和成纖維(wei)細(xi)胞(bao)耐受性可(ke)能大些，骨(gu)髓干細(xi)胞(bao)－2~－3℃/分(fen)鐘合適；胚胎(tai)細(xi)胞(bao)耐受性較(jiao)小，不宜太快(kuai)。總之在一開始時，下降速度不能超過(guo)－10℃/分(fen)鐘。

5. 用(yong)什么(me)防護劑合(he)適和(he)用(yong)量(liang)多大(da)，要依細(xi)(xi)胞(bao)而(er)定，初代培(pei)養細(xi)(xi)胞(bao)用(yong)DMSO 較(jiao)好，一般細(xi)(xi)胞(bao)可用(yong)甘油；用(yong)量(liang)以(yi)較(jiao)小(xiao)為(wei)好。有人認為(wei)人皮(pi)膚上皮(pi)細(xi)(xi)胞(bao)貯存(cun)在20%-30%甘油中很(hen)好。

6. 原則上(shang)細胞在液氮中可貯(zhu)存(cun)多年，但為妥善起(qi)見(jian)，凍存(cun)一年后，應(ying)再復(fu)蘇培養一次，然后再繼(ji)續凍存(cun)。

7. 將凍存管(guan)放(fang)入液(ye)氮容器或從中取(qu)出時，要做好防護(hu)工作，以免凍傷

8. 注意自身的(de)安全(quan)，對于來(lai)自人(ren)源(yuan)性(xing)(xing)或病毒感(gan)染的(de)細胞株應(ying)特別小心。操(cao)作(zuo)過(guo)程(cheng)中，應(ying)避免引起(qi)氣溶(rong)膠的(de)產生，小心有毒性(xing)(xing)試劑(ji)例如DMSO，并避免尖銳物品傷人(ren)等。