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闡明PCR引物的設計原則
引(yin)物(wu)(wu)的(de)特異(yi)性(xing)決定(ding)PCR反應(ying)特異(yi)性(xing)。因此引(yin)物(wu)(wu)設(she)計是否合(he)理對(dui)于整(zheng)個(ge)實驗有著至關重要(yao)的(de)影響。在引(yin)物(wu)(wu)設(she)計時要(yao)充分考慮到可(ke)能存(cun)在的(de)同源序列，同種(zhong)蛋(dan)白(bai)的(de)不同亞型，不同的(de)mRNA剪切方式以及(ji)可(ke)能存(cun)在的(de)hnRNA對(dui)引(yin)物(wu)(wu)的(de)特異(yi)性(xing)的(de)影響。盡量選(xuan)擇(ze)覆蓋相連兩個(ge)內含(han)子(zi)的(de)引(yin)物(wu)(wu)，或者在目的(de)蛋(dan)白(bai)表(biao)達過程中特異(yi)存(cun)在而在其他亞型中不存(cun)在的(de)內含(han)子(zi)。
引(yin)物設(she)計(ji)原(yuan)則包括:
1）、引(yin)物長(chang)度:一般為15～30 bp ，引(yin)物太短會(hui)影響PCR的特異性，引(yin)物太長(chang)PCR的最適延伸溫(wen)度會(hui)超(chao)過Taq酶的最適溫(wen)度，也影響反應的特異性。
2）、堿基(ji)分布：四種(zhong)堿基(ji)最好應隨(sui)機分布，避免(mian)嘌(piao)呤或嘧啶的聚集(ji)存(cun)在(zai)，特別是連(lian)續出現3個(ge)以上的單(dan)一堿基(ji)。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR擴增的復性溫度一般(ban)是較低Tm值減去5～10度。
3）、3‘端(duan)要求：3’端(duan)必須與模板嚴格互補，不能進(jin)行任(ren)(ren)何修飾(shi)，也不能有形成(cheng)任(ren)(ren)何二級結(jie)構的(de)(de)可能。末位堿基是(shi)A時(shi)錯配的(de)(de)引(yin)發效率最低(di)，G、C居中間，因此(ci)引(yin)物的(de)(de)3’端(duan)最好選(xuan)用A、G、C而(er)盡(jin)可能避免(mian)連續出現(xian)兩個(ge)以上的(de)(de)T。
4）、引物(wu)自身(shen)二級結構：引物(wu)自身(shen)不應存在互補序列，否(fou)則(ze)會自身(shen)折疊成發(fa)夾狀(zhuang)結構或引物(wu)自身(shen)復性(xing)。
5）、引(yin)物之間的二級結(jie)構：兩引(yin)物之間不(bu)應(ying)有多于(yu)4個連續堿基互補(bu)，3’端不(bu)應(ying)超過2個。
6）、同(tong)源序列(lie)：引(yin)物與非特異擴增序列(lie)的同(tong)源性應小于(yu)連續8個(ge)的互補堿基存(cun)在。
7）、5’端無(wu)嚴格限制：5’末端堿(jian)基可(ke)以游離，但(dan)最好是(shi)G或(huo)C，使(shi)PCR產物的末端結(jie)合穩定。還(huan)可(ke)以進行特異修飾（標(biao)記、酶切位點等(deng)）等(deng)等(deng)。
根據實(shi)驗目的選(xuan)擇適當的引(yin)物。常用(yong)引(yin)物設計軟(ruan)件(jian)如(ru)Primer5.0，Oligo6.0等對(dui)于這些(xie)條件(jian)都可以自行設置。
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