PCR反應溫度與時間的設置

   溫(wen)(wen)度(du)與時間(jian)的(de)(de)設置： 基(ji)于(yu)PCR原理三步(bu)驟而設置變(bian)(bian)性(xing)-退(tui)火(huo)-延伸三個溫(wen)(wen)度(du)點。在(zai)標準反應(ying)中(zhong)采(cai)用三溫(wen)(wen)度(du)點法，雙(shuang)鏈DNA在(zai)90～95℃變(bian)(bian)性(xing)，再迅(xun)速(su)冷(leng)卻至(zhi)40 ～60℃，引物(wu)退(tui)火(huo)并(bing)結(jie)合(he)到靶(ba)(ba)序列上，然(ran)后(hou)快速(su)升(sheng)溫(wen)(wen)至(zhi)70～75℃，在(zai)Taq DNA 聚合(he)酶的(de)(de)作用下，使(shi)引物(wu)鏈沿模板延伸。對于(yu)較短靶(ba)(ba)基(ji)因(長(chang)度(du)為100～300bp時)可(ke)采(cai)用二(er)溫(wen)(wen)度(du)點法， 除變(bian)(bian)性(xing)溫(wen)(wen)度(du)外、退(tui)火(huo)與延伸溫(wen)(wen)度(du)可(ke)合(he)二(er)為一，一般采(cai)用94℃變(bian)(bian)性(xing)，65℃左右(you)退(tui)火(huo)與延伸(此溫(wen)(wen)度(du)Taq DNA酶仍有較高的(de)(de)催化活性(xing))。

1、變性溫度與時間：

變(bian)性溫(wen)度低，解鏈不(bu)wan全(quan)是導致(zhi)PCR失敗(bai)的最主(zhu)要原因(yin)。一(yi)般情況(kuang)下，93℃～94℃lmin足(zu)以使模板(ban)DNA變(bian)性，若(ruo)低于93℃則(ze)需(xu)延(yan)長時(shi)間，但溫(wen)度不(bu)能過高(gao)，因(yin)為(wei)高(gao)溫(wen)環境對(dui)酶(mei)的活性有影響(xiang)。此(ci)步若(ruo)不(bu)能使靶基因(yin)模板(ban)或PCR產物wan全(quan)變(bian)性，就會導致(zhi)PCR失敗(bai)。

2、退火(復性)溫度與時間：

退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20 個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復性溫度=Tm值-(5～10℃)
在(zai)Tm值(zhi)允許范圍(wei)內， 選擇較高(gao)的(de)復性(xing)溫(wen)度可(ke)大(da)大(da)減少引物和(he)模(mo)板間的(de)非特(te)異性(xing)結合(he)，提(ti)高(gao)PCR反應(ying)的(de)特(te)異性(xing)。復性(xing)時(shi)間一般為30～60sec，足以使引物與模(mo)板之間wan全結合(he)。

3、延伸溫度與時間：

Taq DNA聚合酶的生物學活性：
70～80℃ 150 核苷酸/S/酶分子
70℃ 60 核苷酸/S/酶分子
55℃ 24 核苷酸/S/酶分子
高于90℃時， DNA 合成幾乎不能進行。
PCR反(fan)應(ying)的(de)(de)延(yan)(yan)伸(shen)(shen)溫(wen)度(du)一般(ban)選擇在70～75℃之間(jian)(jian)，常(chang)用溫(wen)度(du)為72℃，過高的(de)(de)延(yan)(yan)伸(shen)(shen)溫(wen)度(du)不利于引(yin)物和(he)模板的(de)(de)結合。PCR延(yan)(yan)伸(shen)(shen)反(fan)應(ying)的(de)(de)時(shi)間(jian)(jian)，可根據待(dai)擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)片段的(de)(de)長度(du)而定，一般(ban)1Kb以(yi)內的(de)(de)DNA片段，延(yan)(yan)伸(shen)(shen)時(shi)間(jian)(jian)1min是足夠 的(de)(de)。3～4kb的(de)(de)靶序列需3～4min；擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)10Kb 需延(yan)(yan)伸(shen)(shen)至15min。延(yan)(yan)伸(shen)(shen)進(jin)間(jian)(jian)過長會導致非特異性擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)帶的(de)(de)出現。對(dui)低濃度(du)模板的(de)(de)擴(kuo)增(zeng)(zeng)(zeng)，延(yan)(yan)伸(shen)(shen)時(shi)間(jian)(jian)要(yao)稍長些(xie)。