PCR反應溫度與時間的設置

   溫(wen)(wen)(wen)度(du)與(yu)時間(jian)的(de)設置： 基于PCR原理三步驟而設置變(bian)性-退(tui)火(huo)(huo)-延伸(shen)(shen)三個溫(wen)(wen)(wen)度(du)點(dian)。在(zai)(zai)標準反應(ying)中采(cai)用三溫(wen)(wen)(wen)度(du)點(dian)法(fa)，雙鏈(lian)DNA在(zai)(zai)90～95℃變(bian)性，再(zai)迅速冷卻至40 ～60℃，引物(wu)退(tui)火(huo)(huo)并結合到靶序列上，然后快速升溫(wen)(wen)(wen)至70～75℃，在(zai)(zai)Taq DNA 聚合酶(mei)的(de)作用下(xia)，使引物(wu)鏈(lian)沿(yan)模板延伸(shen)(shen)。對(dui)于較(jiao)短靶基因(長(chang)度(du)為(wei)100～300bp時)可(ke)采(cai)用二(er)溫(wen)(wen)(wen)度(du)點(dian)法(fa)， 除(chu)變(bian)性溫(wen)(wen)(wen)度(du)外、退(tui)火(huo)(huo)與(yu)延伸(shen)(shen)溫(wen)(wen)(wen)度(du)可(ke)合二(er)為(wei)一(yi)，一(yi)般(ban)采(cai)用94℃變(bian)性，65℃左右退(tui)火(huo)(huo)與(yu)延伸(shen)(shen)(此溫(wen)(wen)(wen)度(du)Taq DNA酶(mei)仍(reng)有較(jiao)高的(de)催化(hua)活性)。

1、變性溫度與時間：

變(bian)性溫(wen)(wen)度(du)低，解(jie)鏈不wan全是導(dao)致PCR失敗的(de)最主要原因(yin)。一(yi)般情(qing)況下，93℃～94℃lmin足以使(shi)模板DNA變(bian)性，若(ruo)低于(yu)93℃則需延長時間，但溫(wen)(wen)度(du)不能過高，因(yin)為高溫(wen)(wen)環(huan)境對(dui)酶的(de)活(huo)性有(you)影響。此步(bu)若(ruo)不能使(shi)靶基因(yin)模板或PCR產物wan全變(bian)性，就會導(dao)致PCR失敗。

2、退火(復性)溫度與時間：

退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對于20 個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復性溫度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允許范圍(wei)內(nei)， 選(xuan)擇較高的(de)(de)復(fu)性溫度可大(da)大(da)減少(shao)引物和模板間的(de)(de)非特異(yi)性結(jie)合，提高PCR反應的(de)(de)特異(yi)性。復(fu)性時間一般(ban)為30～60sec，足以使引物與(yu)模板之間wan全結(jie)合。

3、延伸溫度與時間：

Taq DNA聚合酶的生物學活性：
70～80℃ 150 核苷酸/S/酶分子
70℃ 60 核苷酸/S/酶分子
55℃ 24 核苷酸/S/酶分子
高于90℃時， DNA 合成幾乎不能進行。
PCR反應(ying)(ying)的(de)(de)(de)延(yan)(yan)伸(shen)溫度一般選(xuan)擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過(guo)高(gao)的(de)(de)(de)延(yan)(yan)伸(shen)溫度不利(li)于引物和模板(ban)的(de)(de)(de)結合。PCR延(yan)(yan)伸(shen)反應(ying)(ying)的(de)(de)(de)時(shi)間，可(ke)根據待擴(kuo)增(zeng)(zeng)片段(duan)的(de)(de)(de)長(chang)度而(er)定，一般1Kb以內的(de)(de)(de)DNA片段(duan)，延(yan)(yan)伸(shen)時(shi)間1min是足夠 的(de)(de)(de)。3～4kb的(de)(de)(de)靶序列(lie)需3～4min；擴(kuo)增(zeng)(zeng)10Kb 需延(yan)(yan)伸(shen)至15min。延(yan)(yan)伸(shen)進間過(guo)長(chang)會導致非特異性擴(kuo)增(zeng)(zeng)帶(dai)的(de)(de)(de)出現。對低濃度模板(ban)的(de)(de)(de)擴(kuo)增(zeng)(zeng)，延(yan)(yan)伸(shen)時(shi)間要稍長(chang)些。