逆轉錄實驗要素具體是什么

逆轉錄（reverse transcription）是以 RNA 為模板合成 DNA 的過程，即 RNA 指導下的 DNA 合成。是某些病毒的復制形式，需逆轉錄酶的催化。艾滋病病毒(HIV)就是一種典型的逆轉錄病毒。逆轉錄實驗包括3大要素，分別是引物、逆轉錄酶和 RNA 模板：

1. 引物：逆轉錄引(yin)物主要有3種，包(bao)括(kuo) Oligo（dT）、Random Primers 和基(ji)(ji)因特(te)(te)異性引(yin)物（GSP）。其中 Oligo（dT）具有12-20個 T 堿(jian)基(ji)(ji)，并(bing)且(qie)與真核(he)生物 mRNA 的(de)(de) 3’Poly A 尾(wei)配(pei)對(dui)，可合(he)(he)成全長的(de)(de) cDNA，但(dan)僅擴(kuo)增有 polyA 尾(wei)的(de)(de) mRNA ，對(dui)模(mo)板質量要求高(gao)，較適合(he)(he)克隆實驗(yan)。而 Random Primers 具有6-9個堿(jian)基(ji)(ji)，可隨機識別模(mo)板并(bing)結(jie)合(he)(he)，適合(he)(he)復雜結(jie)構和微量模(mo)板，但(dan)特(te)(te)異性低，小片段多，適合(he)(he)后續(xu) qPCR 實驗(yan)。基(ji)(ji)因特(te)(te)異性引(yin)物可以識別特(te)(te)定模(mo)板序列(lie)，具有特(te)(te)異性強，靈敏(min)度高(gao)的(de)(de)特(te)(te)點，但(dan)需(xu)合(he)(he)成特(te)(te)定的(de)(de)序列(lie)。所以根據不同實驗(yan)需(xu)求可進行(xing)相應引(yin)物的(de)(de)選擇。

2. 逆轉錄酶：一種是(shi)來(lai)(lai)自純化的(de)(de)禽(qin)成髓細胞瘤病(bing)毒（AMV），由兩條肽(tai)鏈組(zu)成，具有聚合酶活性(xing)(xing)和很強的(de)(de) RNaseH 活性(xing)(xing)，它最適(shi)溫度是(shi)42℃，最適(shi) pH8.3，在高反應溫度時可消除 mRNA 的(de)(de)二級結構對(dui)逆轉錄的(de)(de)阻礙(ai)，然(ran)而高水(shui)平的(de)(de) RNaseH 的(de)(de)活性(xing)(xing)既(ji)抑制 cDNA 產生(sheng)也限制其長度。另一種來(lai)(lai)源(yuan)于鼠白血病(bing)病(bing)毒（M-MLV），是(shi)單肽(tai)鏈的(de)(de)，有 RNA 聚合酶活性(xing)(xing)和相對(dui)較弱的(de)(de) RNaseH 活性(xing)(xing)，最適(shi)溫度37℃，最適(shi) pH7.6，較弱的(de)(de)  RNaseH 活性(xing)(xing)對(dui)獲得2-3kb的(de)(de) mRNA 的(de)(de)全(quan)長 cDNA 有很大好(hao)處(chu)。

3. RNA 模板：通(tong)常利(li)用紫(zi)外分光(guang)光(guang)度計檢(jian)測純度，要求(qiu)A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2。利(li)用瓊脂(zhi)糖凝(ning)(ning)膠電泳(yong)檢(jian)測 RNA 的(de)完整度，完整的(de)總 RNA 在進行瓊脂(zhi)糖凝(ning)(ning)膠電泳(yong)時會產生清晰(xi)的(de)28S 和18S rRNA 條帶(dai)(dai)（真核樣品），28S rRNA  條帶(dai)(dai)的(de)強(qiang)度應當(dang)大致為18S rRNA 條帶(dai)(dai)的(de)兩倍，并且無 gDNA 和蛋(dan)白殘留。