PCR反應所需條件詳解

     PCR反應條(tiao)件為溫度(du)、時間和(he)循環次數。

 溫度與時間的設置：基于PCR原理(li)三步驟而設置變性-退(tui)火(huo)-延伸三個溫(wen)度點。在標準(zhun)反應(ying)中采(cai)用三溫(wen)度點法，雙鏈(lian)DNA在90～95℃變性(xing)，再迅速冷卻至(zhi)40 ～60℃，引物退火并(bing)結合到靶序列(lie)上，然后快速(su)升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作(zuo)用下(xia)，使引物鏈沿模板延伸。對于(yu)較短靶基因(yin)（長度為(wei)100～300bp時）可采用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合(he)二為(wei)一(yi)，一(yi)般(ban)采用94℃變性，65℃左右(you)退火與(yu)延(yan)伸（此(ci)溫度Taq DNA酶(mei)仍有較高的催化活性）。

1、變性溫(wen)度與時間：

變性溫度低(di)，解鏈不*是導致PCR失(shi)敗的最(zui)主(zhu)要原因。一(yi)般情況(kuang)下，93℃～94℃min足以使(shi)模板DNA變性(xing)，若低(di)于93℃則需(xu)延長時間，但溫度不能過高，因(yin)為高溫環境對酶的活性有(you)影(ying)響。此步若不能使(shi)靶基(ji)因(yin)模板或(huo)PCR產物*變性，就會導致PCR失敗。

2、退火（復(fu)性）溫度與時間：

退火溫度是(shi)影響(xiang)PCR特異(yi)性(xing)的較重要因(yin)素。變性(xing)后溫度(du)快(kuai)速冷卻至40℃～60℃，可使引(yin)物(wu)和模板發生結合。由(you)于模板DNA 比引物復雜得(de)多(duo)，引物和模(mo)板(ban)之(zhi)間的(de)碰撞結合機會遠遠高(gao)于模(mo)板(ban)互補鏈之(zhi)間的(de)碰撞。退(tui)火溫度與時間，取決于引物的(de)長度、堿基組成(cheng)及其濃度，還(huan)有靶基序列的(de)長度。對于20個(ge)核苷(gan)酸，G+C含量約50%的引(yin)物，55℃為選(xuan)擇最適退火(huo)溫(wen)度(du)(du)的起點較為理想。引物的復性溫(wen)度(du)(du)可通過以下公式幫助(zhu)選(xuan)擇合適的溫(wen)度(du)(du)：

Tm值（解(jie)鏈溫度）=4(G+C)+2(A+T)

復(fu)性溫度(du)=Tm值-(5～10℃）

在Tm值允許范圍內， 選擇(ze)較高的復(fu)性溫度可大大減(jian)少引物和(he)模板(ban)間的非特異性結合， 提高PCR反應的特異性(xing)。復性(xing)時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間*結(jie)合(he)。

3、延伸溫度與時間(jian)：Taq DNA聚(ju)合酶的(de)生物(wu)學活性(xing)：

70～80℃ 150核(he)苷酸(suan)/S/酶分(fen)子

70℃ 60核苷酸(suan)/S/酶分子

55℃ 24核苷酸(suan)/S/酶分子

高(gao)于90℃時， DNA合成幾乎(hu)不能(neng)進行。

PCR反應(ying)的(de)延伸溫(wen)度一般選擇在70～75℃之間，常用溫(wen)度為72℃，過(guo)高的(de)延伸溫(wen)度不(bu)利于引物和模板的(de)結合。PCR延伸(shen)反(fan)應的時(shi)間，可根(gen)據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以(yi)內(nei)的DNA片段，延(yan)伸(shen)時間1min是(shi)足夠 的。3～4kb的(de)靶序列需3～4min；擴(kuo)增10Kb需延伸(shen)至15min。延(yan)伸時(shi)間(jian)過長會導致非特(te)異性擴增帶的出現。對低濃度(du)模板的擴增，延(yan)伸時(shi)間(jian)要稍長些。