ELISA實驗HRP底物分析

   ELISA試劑盒中HRP底物范圍較廣，HRP即辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase）比活性高，穩定，分子量小，純酶容易制備，所以zui 常用。過氧化物酶作為多個試劑盒顯色體系的關鍵成分，對試劑盒的質量有重要影響。HRP底物主要包括二氨基聯苯胺(DAB)、氯萘酚和氨乙基咔唑等。

一、二氨基聯苯胺／金屬鹽

DAB是(shi)辣(la)根過氧(yang)化物(wu)酶(mei)最(zui)敏感(gan)、常用的底(di)(di)物(wu)。它產生強烈的棕色(se)(se)(se)產物(wu)，在(zai)水(shui)和醇中不溶(rong)解。多數情況(kuang)下，推薦在(zai)DAB中加(jia)入不同的金屬離子。當加(jia)入金屬鹽如(ru)鈷、鎳(nie)至底(di)(di)物(wu)液中，辣(la)根過氧(yang)化物(wu)酶(mei)可以更加(jia)敏感(gan)。此類(lei)反應產物(wu)呈暗藍灰色(se)(se)(se)至黑色(se)(se)(se)，且在(zai)水(shui)及醇中穩定。DAB／金屬鹽染色(se)(se)(se)應用的組織(zhi)染色(se)(se)(se)范(fan)圍較(jiao)廣(guang)。

1.     需要的溶液和特殊設備

DAB，0.05 mol／LTris緩沖液(pH7.6), 0.3％ (W/V) 氯化(hua)鎳(nie)/水貯存液, 30％過氧化(hua)氫, DPX, 光學顯微(wei)鏡(通常帶有照相(xiang)機以便于(yu)記(ji)錄結果).

2.     操作(zuo)步驟

(1) 用 9 mL 0.05 mol/L Tris緩沖液(pH7.6)溶解6 mg DAB；

(2) 加 l mL 0.3％(W/V)氯(lv)(lv)化(hua)鎳(nie)/水(shui)貯存液(也可以用(yong)等(deng)量的(de)氯(lv)(lv)化(hua)鈷(gu)替代(dai))；

(3) 加0.1 mL 3％過氧(yang)化氫。過氧(yang)化氫一般以30％的溶液提供，貯(zhu)存在4 ℃，此(ci)條(tiao)件可以持續1個(ge)月(yue)；

(4) 如果出(chu)現(xian)沉淀，用濾紙過(guo)濾；

(5) 加此(ci)溶液至標本，并孵育1~20 min水(shui)洗終(zhong)止反應；

(6) 優化：如果需要可(ke)復染；

(7) 用DPX封片。

二、氯萘酚

氯萘酚可(ke)以形成一種藍黑色(se)產物。敏感(gan)性低(di)于DAB，且(qie)產物可(ke)溶于醇中。它適用于當DAB反應形成較高背景或要(yao)求改變產物的顏色(se)。

1.     需要的溶液和特殊設(she)備

0.03％氯萘(nai)酚(fen)，用(yong)無(wu)水乙醇(chun)溶解(貯存在-20℃)，0.05 mol／LTris(pH7.6)，過氧化氫，Gelvatol或者(zhe)Mowiol，光學(xue)顯(xian)微鏡(通常帶有照相(xiang)機以便于記錄結果)。

2.     操作步驟

(1) 氯(lv)萘(nai)酚貯(zhu)存液的準(zhun)備：用10 mL無水(shui)乙醇溶解0.3 g氯(lv)萘(nai)酚，貯(zhu)存于-20℃；

(2) 加100 μL 氯萘酚貯(zhu)存液至10 mL 0.05 mol/LTris(pH7.6)；

(3) 加0.1 mL 3％過氧化氫于水中。過氧化氫一般是以(yi)30％的(de)溶液提供，4℃可存放(fang)1個(ge)月；

(4) 白色沉淀(dian)可(ke)用(yong)濾(lv)紙過濾(lv)去除；

(5) 加(jia)此溶液(ye)到(dao)標(biao)本(ben)中，并在室(shi)溫孵育(yu)10～40 min，水(shui)洗終(zhong)止反應；

(6) 優化(hua)：如果需要，進行復(fu)染，但只可使用水溶性(xing)染料；

(7) 用Gelvatol或者Mowiol封片。

三、氨乙基咔唑

氨乙基咔唑(AEC)產生紅色產物(wu)，其(qi)敏感性低于DAB，但(dan)可用于DAB反應產生較(jiao)高背景或(huo)要求改變(bian)產物(wu)顏色的實驗。此產物(wu)可溶于醇，但(dan)不溶于水。

1.     需要的(de)溶液和特殊設備

0.4％ AEC用(yong) N,N—二甲(jia)基甲(jia)酰胺(DMF)溶(rong)解， 0.1 mol/L乙酸鈉緩沖液(ye)(pH5.2)，過氧化氫(qing)， Gelvatol或Mowiol，光學(xue)顯微鏡(通(tong)常(chang)帶(dai)有照相機(ji)以便于記錄結果)。

2.     操作步驟

(1) 用(yong)(yong) l mL DMF溶(rong)解(jie) 4 mg AEC。AEC在DMF中穩(wen)定，因此(ci)，可以用(yong)(yong)100 mL DMF溶(rong)解(jie)0.4 g AEC作為貯存液備用(yong)(yong)；

(2) 加 l mL AEC溶(rong)液至(zhi)15 mL 0.1 mol/L的乙酸鈉緩(huan)沖液(pH5.2)中，并攪拌；

(3) 加0.15 mL 3％過(guo)氧化氫(qing)于水中。過(guo)氧化氫(qing)一般是(shi)30％的溶液提供，在4℃可存(cun)放(fang)1個月(yue)；

(4) 用(yong)濾(lv)紙過濾(lv)；

(5) 加此溶液到標本中，并于室溫(wen)孵育10～40 min，水洗終止反應(ying)；

(6) 優(you)化：如果需要復染，只可用水溶(rong)性染料；

(7) 用Gelvatol或(huo)Mowiol封片。