1、典型(xing)的(de)引物(wu)18到24個核(he)苷長(chang)(chang)。引物(wu)需要(yao)足夠(gou)長(chang)(chang)，保證(zheng)序(xu)(xu)列(lie)獨特性，并(bing)降低序(xu)(xu)列(lie)存在于非目的(de)序(xu)(xu)列(lie)位點的(de)可能性。但是長(chang)(chang)度大于24核(he)苷的(de)引物(wu)并(bing)不意味著(zhu)更高(gao)的(de)特異性。較長(chang)(chang)的(de)序(xu)(xu)列(lie)可能會與錯(cuo)誤配對序(xu)(xu)列(lie)雜交，降低了特異性，而且比短序(xu)(xu)列(lie)雜交慢，從而降低了產量(liang)。 

2、選擇GC含量為40％到60％或GC含量映像(xiang)模板GC含量的(de)引物。 

3、設計5'端和(he)(he)中間區為G或C的(de)(de)引物(wu)。這會增加(jia)引物(wu)的(de)(de)穩定性(xing)和(he)(he)引物(wu)同目的(de)(de)序列雜交的(de)(de)穩定性(xing)。  

4、避(bi)免引物對3'末(mo)端存在互補序列，這會形成引物二聚(ju)體，抑制(zhi)擴增(zeng)。 

5、避免3'末端(duan)富含(han)GC。設計引物時保證在最后5個核苷中含(han)有3個A或T。 

6、避免3'末端的錯(cuo)誤配對。3'端核(he)苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。

7、避(bi)免存在(zai)可能會(hui)產生內部(bu)二級結構的(de)序(xu)列，這(zhe)會(hui)破壞引物退火穩(wen)定性(xing)。

目的(de)序(xu)列(lie)上并不(bu)(bu)存在的(de)附加序(xu)列(lie)，如限制位(wei)點和啟動子序(xu)列(lie)，可以加入到引物(wu)5'端(duan)而不(bu)(bu)影響特(te)異性(xing)。當計算引物(wu)Tm值時(shi)并不(bu)(bu)包括(kuo)這些序(xu)列(lie)，但是應該對其進行互補性(xing)和內部二(er)級結構的(de)檢測(ce)。  

有(you)時候，對(dui)于引(yin)(yin)物(wu)(wu)設計僅了解有(you)限的(de)(de)序列(lie)信息。比如，如果僅知道氨(an)基酸序列(lie)，可以設計兼(jian)(jian)(jian)并引(yin)(yin)物(wu)(wu)。兼(jian)(jian)(jian)并引(yin)(yin)物(wu)(wu)是指代表編碼(ma)單個(ge)氨(an)基酸所有(you)不(bu)(bu)同(tong)(tong)(tong)堿(jian)(jian)(jian)基可能性(xing)(xing)(xing)的(de)(de)不(bu)(bu)同(tong)(tong)(tong)序列(lie)的(de)(de)混合物(wu)(wu)。為(wei)了增加特異性(xing)(xing)(xing)，可以參(can)考密碼(ma)子使用(yong)(yong)表，根據(ju)不(bu)(bu)同(tong)(tong)(tong)生物(wu)(wu)的(de)(de)堿(jian)(jian)(jian)基使用(yong)(yong)偏(pian)好，減少兼(jian)(jian)(jian)并性(xing)(xing)(xing)。次(ci)黃嘌呤可以同(tong)(tong)(tong)所有(you)的(de)(de)堿(jian)(jian)(jian)基配對(dui)，降低引(yin)(yin)物(wu)(wu)的(de)(de)退(tui)火溫度。不(bu)(bu)要在(zai)引(yin)(yin)物(wu)(wu)的(de)(de)3'端使用(yong)(yong)兼(jian)(jian)(jian)并堿(jian)(jian)(jian)基，因(yin)為(wei)3'端最后3個(ge)堿(jian)(jian)(jian)基的(de)(de)退(tui)火足以在(zai)錯誤位點(dian)起始(shi)PCR。使用(yong)(yong)較高的(de)(de)引(yin)(yin)物(wu)(wu)濃度（1μM到(dao)3μM），因(yin)為(wei)許多兼(jian)(jian)(jian)并混合物(wu)(wu)中的(de)(de)引(yin)(yin)物(wu)(wu)不(bu)(bu)是特異性(xing)(xing)(xing)針對(dui)目的(de)(de)模(mo)板。