PCR反應引物設計重要內容

     在整個PCR體系中，引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結合，不與其他非目的的DNA結合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能與引物進行有效的延伸，可見引物設計好壞與PCR結果密切相關。

1.引物長度

一般引物長度為18~30堿基。總的說來，決定引物退火溫度最重要的因素就是引物的長度。引物的退火溫度一般選擇引物的（Tm值-5℃），有的直接用Tm值。有以下公式可以用于粗略計算引物的退火溫度。

在引物長度小于20bp時：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃

在引物長度大于20bp時：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外有許多軟件也可以對退火溫度進行計算，其計算原理會各有不同，因此有時計算出的數值可能會有少量差距。為了優化PCR反應，使用確保退火溫度不低于54℃的最短的引物可獲得最好的效率和特異性。

總的說來，每增加一個核苷酸，引物特異性提高4倍，這樣，大多數應用的最短引物長度為18個核苷酸。引物長度的上限并不很重要，主要與反應效率有關。由于熵的原因，引物越長，它退火結合到靶DNA上形成供DNA聚合酶結合的穩定雙鏈模板的速率越小。

在利用軟件設計引物的時候，可以通過TM值反過來決定引物的長度，特別是熒光定量PCR的引物，要控制TM=60℃左右。

2.GC含量

一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%，一對引物的GC含量和Tm值應該協調。若是引物存在嚴重的GC傾向或AT傾向則可以在引物5’端加適量的A、T或G、C尾巴。

3.退火溫度

退火溫度需要比解鏈溫度低5℃，如果引物堿基數較少，可以適當提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數較多，那么可以適當減低退火溫度。一對引物的退火溫度相差4℃～6℃不會影響PCR的產率，但是理想情況下一對引物的退火溫度是一樣的，可以在55℃～75℃間變化。

4.避免擴增模板的二級結構區域

選擇擴增片段時最好避開模板的二級結構區域。用有關計算機軟件可以預測估計目的片段的穩定二級結構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△G）小于58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。

5.與靶DNA的錯配

當被擴增的靶DNA序列較大的時候，一個引物就有可能與靶DNA的多個地方結合，造成結果中有多個條帶出現。這個時候有必要先使用BLAST軟件進行檢測，

將引物序列粘貼到1區，將靶DNA序列粘貼到2區，這兩者可以互換的，并且BLAST會計算互補、反義鏈等多種可能，所以不需要用戶注意兩條鏈是否都是有義鏈。如果知道序列在數據庫中的GI號也可以直接輸入GI號，這樣就不用粘貼一大段的序列了。最后在3處點擊Align就可以查看引物在靶DNA中是否有多個同源位點了。

6.引物末端

引物3’端是延伸開始的地方，因此要防止錯配就從這里開始。3’端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在G+C富集序列區錯誤引發。3′端也不能有形成任何二級結構可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反應中，引物3′端不能發生錯配。如擴增編碼區域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡并，會影響擴增特異性與效率。使用兼并引物時, 要參考密碼子使用表，注意生物的偏好性，不要在3'端使用兼并引物，并使用較高的引物濃度(1uM-3uM) 。

7.引物的二級結構

引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾狀結構，這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。若用人工判斷，引物自身連續互補堿基不能大于3bp。兩引物之間不應該存在互補性，尤應避免3′端的互補重疊以防引物二聚體的形成。一般情況下，一對引物間不應多于4個連續堿基的同源性或互補性。

8.添加標記或者位點

5’端對擴增特異性影響不大，因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入突變位點、插入與缺失突變序列和引入一啟動子序列等。額外的堿基或多或少會影響擴增的效率，還加大引物二聚體形成的幾率，但是為了下一步的操作就要作出適當的讓步。目的序列上并不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當計算引物Tm值時并不包括這些序列，但是應該對其進行互補性和內部二級結構的檢測。

9.亞克隆

很多時候PCR只是初步克隆，之后我們還需要將目的片段亞克隆到各種載體上，那么就需要在PCR這個步驟為下一步的操作設計額外的堿基。

10.兼并引物

有時候，對于引物設計僅了解有限的序列信息。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設計兼并引物。兼并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據不同生物的堿基使用偏好，減少兼并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用兼并堿基，因為3'端最后3個堿基的退火足以在錯誤位點起始PCR。使用較高的引物濃度（1μM到3μM），因為許多兼并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。