PCR反應引物設計重要內容

     在整個PCR體系中，引物占有十分重要的地位。PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結合，不與其他非目的的DNA結合，PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能與引物進行有效的延伸，可見引物設計好壞與PCR結果密切相關。

1.引物長度

一(yi)般引(yin)物(wu)(wu)(wu)長度(du)為18~30堿基(ji)。總的說來(lai)，決定引(yin)物(wu)(wu)(wu)退火(huo)溫度(du)最重要(yao)的因(yin)素(su)就是引(yin)物(wu)(wu)(wu)的長度(du)。引(yin)物(wu)(wu)(wu)的退火(huo)溫度(du)一(yi)般選擇引(yin)物(wu)(wu)(wu)的（Tm值-5℃），有的直接用(yong)Tm值。有以下公式可(ke)以用(yong)于粗略計算引(yin)物(wu)(wu)(wu)的退火(huo)溫度(du)。

在引(yin)物長度小于20bp時：[4(G+C)+2(A+T)]-5℃

在(zai)引物長(chang)度大于(yu)20bp時：62.3℃+0.41℃(%G-C)-500/length-5℃

另外(wai)有(you)(you)許多軟件也(ye)可(ke)以對退(tui)火溫(wen)(wen)度進行計(ji)算，其計(ji)算原理會各有(you)(you)不(bu)同，因此(ci)有(you)(you)時計(ji)算出的數(shu)值可(ke)能會有(you)(you)少量(liang)差距。為了(le)優化(hua)PCR反應，使(shi)用確保退(tui)火溫(wen)(wen)度不(bu)低于54℃的最(zui)短的引物可(ke)獲得(de)最(zui)好的效率和(he)特異性(xing)。

總的(de)(de)說來，每增(zeng)加(jia)一個核苷(gan)酸，引(yin)物特異性提高4倍，這樣(yang)，大多(duo)數(shu)應(ying)用(yong)的(de)(de)最短(duan)引(yin)物長度為18個核苷(gan)酸。引(yin)物長度的(de)(de)上限并不很(hen)重要(yao)，主要(yao)與(yu)反應(ying)效率有關。由于(yu)熵(shang)的(de)(de)原因，引(yin)物越(yue)長，它(ta)退(tui)火(huo)結(jie)合到靶DNA上形成供DNA聚合酶結(jie)合的(de)(de)穩定雙(shuang)鏈模板的(de)(de)速率越(yue)小。

在利用軟件設計引(yin)物的(de)時候(hou)，可以通過(guo)TM值反(fan)過(guo)來決定引(yin)物的(de)長度，特別(bie)是熒光定量PCR的(de)引(yin)物，要控制TM=60℃左右。

2.GC含量

一(yi)般(ban)引(yin)物序列中G+C含量一(yi)般(ban)為40%~60%，一(yi)對引(yin)物的GC含量和Tm值應該(gai)協調。若是引(yin)物存在嚴重的GC傾(qing)向或AT傾(qing)向則可(ke)以在引(yin)物5’端加適量的A、T或G、C尾巴。

3.退火溫度

退火(huo)溫(wen)(wen)度(du)需要比解鏈溫(wen)(wen)度(du)低(di)5℃，如果引物(wu)堿基數(shu)較(jiao)少，可(ke)以適當(dang)提高退火(huo)溫(wen)(wen)度(du)，這樣可(ke)以使PCR的(de)特異性增(zeng)加；如果堿基數(shu)較(jiao)多，那么可(ke)以適當(dang)減低(di)退火(huo)溫(wen)(wen)度(du)。一(yi)對引物(wu)的(de)退火(huo)溫(wen)(wen)度(du)相差4℃～6℃不會影響PCR的(de)產率，但是(shi)理想情(qing)況下一(yi)對引物(wu)的(de)退火(huo)溫(wen)(wen)度(du)是(shi)一(yi)樣的(de)，可(ke)以在55℃～75℃間變(bian)化。

4.避免擴增模板的二級結構區域

選擇擴增片(pian)段(duan)時最好避開模板的(de)二級(ji)結(jie)(jie)構區域。用有關計算(suan)機軟件可以預測估計目的(de)片(pian)段(duan)的(de)穩定二級(ji)結(jie)(jie)構，有助于選擇模板。實驗表明，待擴區域自由(you)能（△G）小于58.6lkJ/mol時，擴增往(wang)往(wang)不(bu)能成功(gong)。

5.與靶DNA的錯配

當(dang)被擴增的(de)靶DNA序列較(jiao)大的(de)時(shi)候，一(yi)個(ge)引物就有(you)(you)可(ke)能與靶DNA的(de)多個(ge)地(di)方結(jie)合，造成結(jie)果(guo)中有(you)(you)多個(ge)條帶出現。這個(ge)時(shi)候有(you)(you)必(bi)要先使用BLAST軟件進行檢測，

將引物(wu)序(xu)(xu)(xu)列粘(zhan)貼(tie)到1區，將靶DNA序(xu)(xu)(xu)列粘(zhan)貼(tie)到2區，這(zhe)兩者可以互(hu)換(huan)的，并且BLAST會(hui)計(ji)算互(hu)補、反義(yi)鏈等多(duo)種可能(neng)，所以不需(xu)要用戶注意兩條鏈是(shi)否都(dou)是(shi)有義(yi)鏈。如果知道(dao)序(xu)(xu)(xu)列在(zai)數據庫中的GI號也可以直接輸入(ru)GI號，這(zhe)樣就不用粘(zhan)貼(tie)一(yi)大(da)段(duan)的序(xu)(xu)(xu)列了(le)。最后(hou)在(zai)3處點擊Align就可以查(cha)看引物(wu)在(zai)靶DNA中是(shi)否有多(duo)個同源(yuan)位點了(le)。

6.引物末端

引(yin)物(wu)(wu)3’端(duan)(duan)是延伸(shen)開(kai)始的(de)(de)地方(fang)，因此要(yao)(yao)防止錯配(pei)(pei)就從這里開(kai)始。3’端(duan)(duan)不(bu)應(ying)超過3個連(lian)續的(de)(de)G或C，因這樣會使(shi)引(yin)物(wu)(wu)在(zai)G+C富集(ji)序列區錯誤引(yin)發。3′端(duan)(duan)也不(bu)能有形成(cheng)任(ren)何二級結構可(ke)能，除(chu)在(zai)特(te)殊的(de)(de)PCR（AS-PCR）反應(ying)中，引(yin)物(wu)(wu)3′端(duan)(duan)不(bu)能發生(sheng)錯配(pei)(pei)。如擴增(zeng)編碼區域，引(yin)物(wu)(wu)3′端(duan)(duan)不(bu)要(yao)(yao)終(zhong)止于密碼子的(de)(de)第3位，因密碼子的(de)(de)第3位易(yi)發生(sheng)簡(jian)并(bing)，會影響擴增(zeng)特(te)異性與效率。使(shi)用兼(jian)并(bing)引(yin)物(wu)(wu)時, 要(yao)(yao)參考密碼子使(shi)用表，注意生(sheng)物(wu)(wu)的(de)(de)偏好(hao)性，不(bu)要(yao)(yao)在(zai)3'端(duan)(duan)使(shi)用兼(jian)并(bing)引(yin)物(wu)(wu)，并(bing)使(shi)用較高的(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)濃度(1uM-3uM) 。

7.引物的二級結構

引(yin)(yin)物自(zi)身不(bu)(bu)應(ying)存在互(hu)(hu)補序列，否(fou)則引(yin)(yin)物自(zi)身會折疊成(cheng)發(fa)夾狀結(jie)構(gou)，這種二(er)級結(jie)構(gou)會因空間位阻而影(ying)響引(yin)(yin)物與(yu)模(mo)板的(de)復性(xing)(xing)結(jie)合。若用人(ren)工判斷，引(yin)(yin)物自(zi)身連續互(hu)(hu)補堿基不(bu)(bu)能大于3bp。兩(liang)引(yin)(yin)物之間不(bu)(bu)應(ying)該存在互(hu)(hu)補性(xing)(xing)，尤應(ying)避免3′端的(de)互(hu)(hu)補重疊以(yi)防引(yin)(yin)物二(er)聚體(ti)的(de)形(xing)成(cheng)。一般情況下，一對引(yin)(yin)物間不(bu)(bu)應(ying)多于4個連續堿基的(de)同源性(xing)(xing)或(huo)互(hu)(hu)補性(xing)(xing)。

8.添加標記或者位點

5’端(duan)對(dui)擴(kuo)增特異(yi)性(xing)影(ying)響不大，因此，可以被修飾而不影(ying)響擴(kuo)增的(de)(de)特異(yi)性(xing)。引(yin)物(wu)5′端(duan)修飾包括(kuo)：加酶切位點；標記生(sheng)物(wu)素(su)、熒(ying)光、地高辛、Eu3+等；引(yin)入(ru)蛋白(bai)質結(jie)(jie)合DNA序(xu)(xu)(xu)(xu)列；引(yin)入(ru)突(tu)變位點、插入(ru)與缺失突(tu)變序(xu)(xu)(xu)(xu)列和(he)引(yin)入(ru)一啟動子序(xu)(xu)(xu)(xu)列等。額外的(de)(de)堿基或(huo)多或(huo)少會影(ying)響擴(kuo)增的(de)(de)效率，還加大引(yin)物(wu)二聚體形成的(de)(de)幾率，但是(shi)為了下一步(bu)的(de)(de)操(cao)作(zuo)就要作(zuo)出適當的(de)(de)讓(rang)步(bu)。目(mu)的(de)(de)序(xu)(xu)(xu)(xu)列上并(bing)(bing)不存在的(de)(de)附加序(xu)(xu)(xu)(xu)列，如(ru)限制(zhi)位點和(he)啟動子序(xu)(xu)(xu)(xu)列，可以加入(ru)到(dao)引(yin)物(wu)5'端(duan)而不影(ying)響特異(yi)性(xing)。當計算引(yin)物(wu)Tm值(zhi)時并(bing)(bing)不包括(kuo)這(zhe)些序(xu)(xu)(xu)(xu)列，但是(shi)應該對(dui)其(qi)進行互補性(xing)和(he)內部二級(ji)結(jie)(jie)構的(de)(de)檢測。

9.亞克隆

很多時候PCR只(zhi)是初(chu)步(bu)克(ke)隆，之后(hou)我(wo)們還需要(yao)將(jiang)目的(de)(de)片(pian)段亞(ya)克(ke)隆到各種載體上，那么就需要(yao)在PCR這個步(bu)驟為下一步(bu)的(de)(de)操(cao)作設計額外(wai)的(de)(de)堿基。

10.兼并引物

有(you)(you)時(shi)候，對(dui)于(yu)引(yin)物(wu)設計僅(jin)(jin)了解(jie)有(you)(you)限的(de)序(xu)列信息。比如，如果(guo)僅(jin)(jin)知道氨(an)基(ji)酸序(xu)列，可(ke)(ke)(ke)以設計兼(jian)并引(yin)物(wu)。兼(jian)并引(yin)物(wu)是(shi)指(zhi)代表(biao)編碼單個氨(an)基(ji)酸所有(you)(you)不(bu)同堿(jian)基(ji)可(ke)(ke)(ke)能性的(de)不(bu)同序(xu)列的(de)混(hun)合(he)物(wu)。為了增加特異性，可(ke)(ke)(ke)以參(can)考密碼子使(shi)用(yong)表(biao)，根據不(bu)同生物(wu)的(de)堿(jian)基(ji)使(shi)用(yong)偏好，減(jian)少兼(jian)并性。次黃嘌呤可(ke)(ke)(ke)以同所有(you)(you)的(de)堿(jian)基(ji)配(pei)對(dui)，降(jiang)低引(yin)物(wu)的(de)退火溫度(du)。不(bu)要在(zai)引(yin)物(wu)的(de)3'端使(shi)用(yong)兼(jian)并堿(jian)基(ji)，因為3'端最(zui)后3個堿(jian)基(ji)的(de)退火足以在(zai)錯(cuo)誤位點起始PCR。使(shi)用(yong)較高的(de)引(yin)物(wu)濃(nong)度(du)（1μM到3μM），因為許多兼(jian)并混(hun)合(he)物(wu)中的(de)引(yin)物(wu)不(bu)是(shi)特異性針對(dui)目的(de)模板。