聚合酶鏈式反應（PCR）體系包括什么？

        PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚合酶鏈式反應，PCR原理(li)DNA雙鏈復制(zhi)，DNA雙鏈結構(gou)高溫(wen)氫鍵斷裂。目的(de)是在(zai)生物(wu)(wu)(wu)體外大(da)量(liang)擴(kuo)增(zeng)特(te)定DNA片段(duan)(duan)的(de)分子生物(wu)(wu)(wu)學技(ji)術，其特(te)點是可(ke)以以微量(liang)的(de)DNA為模(mo)板，快速擴(kuo)增(zeng)得到(dao)大(da)量(liang)拷貝(bei)。其基本過程(cheng)，首(shou)先將(jiang)待(dai)擴(kuo)增(zeng)的(de)模(mo)板DNA變性(xing)(xing)使(shi)之成(cheng)為單鏈，DNA樣品中，特(te)異(yi)性(xing)(xing)的(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)能夠與(yu)其互補的(de)序列雜交(jiao)，在(zai)dNTPs和Taq酶(mei)存在(zai)時，就(jiu)可(ke)以合(he)成(cheng)模(mo)板DNA的(de)互補鏈，反(fan)(fan)應完成(cheng)后，將(jiang)反(fan)(fan)應混合(he)物(wu)(wu)(wu)加熱使(shi)DNA雙鏈變性(xing)(xing)，溫(wen)度下降(jiang)后，過量(liang)的(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)又(you)可(ke)以開始第二輪的(de)合(he)成(cheng)反(fan)(fan)應。這種延伸-變性(xing)(xing)-退火-延伸的(de)循環(huan)可(ke)以重復多次，使(shi)所需要的(de)DNA片段(duan)(duan)得到(dao)特(te)異(yi)性(xing)(xing)的(de)擴(kuo)增(zeng)。

PCR反應體系由反應(ying)緩沖(chong)液（PCR Buffer）、脫(tuo)氧核苷(gan)三磷酸底物(wu)（dNTP mix）、Taq DNA聚(ju)合酶(mei)（Taq 酶(mei)）、寡聚(ju)核苷(gan)酸引物(wu)（Primer1，Primer2）、 Mg2+、靶序列（DNA模(mo)板(ban)）主要成份組成。各個組份對(dui)PCR結果至關重(zhong)要。

1、 反應緩沖液（PCR Buffer）
（1）、反應(ying)緩沖液一般含(han)10-50 mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8)， 50 mmol/L KCl和適當濃度的Mg2+ 。Tris·Cl在(zai)(zai)20℃時(shi)pH為8.3-8.8，但在(zai)(zai)實(shi)際PCR反應(ying)中，pH為6.8-7.8. 50 mmol/L的KCl有利(li)于(yu)引物(wu)的退(tui)火。
（2）、反應(ying)液可(ke)加(jia)入5mmol/L的(de)二硫(liu)蘇(su)糖醇(DDT)或100 μg/ml的(de)牛血清白蛋白(BSA)，它們(men)可(ke)穩定酶活性，另外加(jia)入T4噬菌體的(de)基因32蛋白則(ze)對擴增較長(chang)的(de)DNA片段有利。
（3）、各種Taq DNA聚合酶(mei)商品(pin)都有自(zi)己特(te)定(ding)的一些緩沖液。

2、 脫氧核苷三磷酸底物（dNTP mix）
dNTP包(bao)括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有(you)密(mi)切關系(xi)，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dang)易變(bian)性失去生物學活(huo)性。多次凍融(rong)會使dNTP降解。dNTP能(neng)與Mg2+結合(he)，使游離的Mg2+濃度降低(di)。當(dang)PCR需要較(jiao)高濃度的dNTP時，應在反應體系(xi)中適當(dang)增加Mg2+的濃度。
（1）dNTP應用(yong)NaOH 將pH調至7.0，并用(yong)分光光度計測(ce)定其準確濃度。
（2）dNTP原液可(ke)配(pei)成5-10 mmol/L并(bing)分裝(zhuang)，-20℃貯存。一般反應中每種dNTP的(de)終濃(nong)度為(wei)20-200 μmol/L。
（3）理論上4 種(zhong)(zhong) dNTP各20 μmol/L，足以(yi)在100 μl反應中合成2.6 μg的(de)DNA。當(dang)dNTP終(zhong)濃度大(da)于50 mmol/L時可抑制Taq DNA聚合酶的(de)活性。4種(zhong)(zhong)dNTP的(de)濃度應該(gai)相等，以(yi)減少合成中由于某種(zhong)(zhong)dNTP的(de)不足出(chu)現(xian)的(de)錯誤摻入。                                                               

3、 Taq DNA聚合酶（Taq 酶）
一(yi)般Taq DNA聚合(he)酶(mei)(mei)活性(xing)半衰期為92.5℃ 130 min，95℃ 40 min， 97℃ 5 min。現在人們(men)又發(fa)現許多新(xin)的耐熱(re)的DNA聚合(he)酶(mei)(mei)，這些酶(mei)(mei)的活性(xing)在高溫(wen)下活性(xing)可維持更長時(shi)間。
Taq DNA聚合酶(mei)(mei)的(de)(de)酶(mei)(mei)活性單位定義為74℃下，30 min，摻入(ru)10 nmol/L dNTP到核(he)酸中所需的(de)(de)酶(mei)(mei)量。Taq DNA聚合酶(mei)(mei)的(de)(de)一個致(zhi)命弱點是它的(de)(de)出(chu)(chu)錯率，一般PCR中出(chu)(chu)錯率為2×10-4 核(he)苷(gan)酸/每輪(lun)循環(huan)，在(zai)利用PCR克隆和進(jin)行序列分析時尤應(ying)注意(yi).在(zai)100 μl PCR反(fan)應(ying)中，1.5-2單位的(de)(de)Taq DNA聚合酶(mei)(mei)就足以進(jin)行30輪(lun)循環(huan)。
所用的酶(mei)量可根據(ju)DNA、引物及(ji)其它因素的變化進(jin)行適當的增減(jian).酶(mei)量過(guo)多(duo)會使產(chan)物非(fei)特異性增加(jia)，過(guo)少(shao)則使產(chan)量降低。
反應(ying)結束后，如果需要利用這些產物進行下(xia)一步實(shi)驗，需要預先滅活Taq DNA聚合酶， 滅活Taq DNA聚合酶的方(fang)法(fa)有：
（1）PCR產物經酚(fen): 抽提，乙(yi)醇沉淀。
（2）加入10 mmol/L的EDTA螯合Mg2+ 。
（3） 99-100℃加(jia)熱10 min。目(mu)前已(yi)有直接純化PCR產(chan)物的(de)Kit可(ke)用(yong)。

4、 寡聚核苷酸引物
PCR反應產物(wu)的(de)特異性由一(yi)對上(shang)下(xia)游引(yin)(yin)物(wu)所決定。引(yin)(yin)物(wu)的(de)好壞往往是(shi)PCR成敗的(de)關鍵(jian)。引(yin)(yin)物(wu)設計和(he)選擇(ze)目的(de)DNA序列區域時可遵(zun)循下(xia)列原則(ze)：
（1） 引物(wu)長(chang)度(du)約為(wei)16-30 bp， 太短會降低退火溫度(du)影響引物(wu)與模板配對(dui)，從而使非特異性增(zeng)高。太長(chang)則比較浪費(fei)，且難以合成。
（2）引物中(zhong)G+C含量(liang)通(tong)常為(wei)40%-60%，可按下式粗略估計引物的解鏈(lian)溫度 Tm＝4(G+C)+2(A+T)。
（3）四種堿基(ji)應隨機分布，在3'端不存在連續3個G或C，因(yin)這(zhe)樣易(yi)導致錯誤(wu)引發。
（4）引物(wu)3'端(duan)最好與目的序列閱讀(du)框架中密碼子(zi)第(di)一或第(di)二位核苷酸對(dui)應， 以減少由于密碼子(zi)擺動產生的不配對(dui)。
（5）在(zai)引物內， 尤(you)其在(zai)3'端應(ying)不存在(zai)二級結(jie)構。
（6）兩引物之(zhi)間尤其在(zai)3'端不能互補， 以防出(chu)現(xian)引物二聚體， 減少產量。兩引物間最好不存在(zai)4個連續堿基的(de)同源(yuan)性或互補性。
（7）引(yin)物(wu)5'端對擴增特異(yi)性(xing)影響不大， 可在(zai)引(yin)物(wu)設計時加(jia)上(shang)限制酶位(wei)點、核糖 體(ti)結合位(wei)點、起(qi)始(shi)密碼子(zi)、缺失或插入突變位(wei)點以及標記生物(wu)素、熒光素等。通常(chang)應在(zai)5'端限制酶位(wei)點外再加(jia)1-2個(ge)保護(hu)堿基。
（8）引物不與(yu)模板結(jie)(jie)合位點以(yi)(yi)外的(de)序列互補。所擴增(zeng)產(chan)物本(ben)身無穩(wen)定(ding)的(de)二級結(jie)(jie)構， 以(yi)(yi)免產(chan)生非特(te)異性擴增(zeng)，影響產(chan)量。
（9）簡并引(yin)物應選(xuan)用(yong)簡并程度低的密(mi)碼子(zi)， 例如選(xuan)用(yong)只(zhi)有一種密(mi)碼子(zi)的Met， 3'端(duan)應不存在簡并性(xing)。否則可(ke)能由于產(chan)量低而(er)看不見擴增產(chan)物。
（10）一(yi)般(ban)PCR反(fan)應中的引(yin)(yin)物(wu)(wu)終濃(nong)度為0.2-1.0 μmol/L。引(yin)(yin)物(wu)(wu)過多會產生(sheng)錯(cuo)誤(wu)引(yin)(yin)導或產生(sheng)引(yin)(yin)物(wu)(wu)二聚體， 過低則(ze)降(jiang)低產量。利用紫外分光光度計(ji)， 可精(jing)確計(ji)算引(yin)(yin)物(wu)(wu)濃(nong)度， 在1cm光程比色杯中，260nm下(xia)，引(yin)(yin)物(wu)(wu)濃(nong)度可按(an)下(xia)式計(ji)算：
X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X： 引物摩爾濃度，A、C、G、T：引物中4種不同堿(jian)基個(ge)數。

5、 Mg2+
（1）Mg2+濃度對Taq DNA聚合酶(mei)影響(xiang)(xiang)很大，它可影響(xiang)(xiang)酶(mei)的活性(xing)和(he)真實性(xing)，影響(xiang)(xiang)引物(wu)退(tui)火和(he)解鏈溫度， 影響(xiang)(xiang)產物(wu)的特異性(xing)以及引物(wu)二聚體的形成(cheng)等。
（2）通常Mg2+ 濃度范圍為0.5-2 mmol/L.對于一(yi)種(zhong)新的PCR反應，可(ke)以用(yong)0.1-5 mmol/L的遞增濃度的Mg2+ 進行預備實驗(yan)，選(xuan)出最適的Mg2+濃度。
（3）在PCR反應(ying)混(hun)合物中， 應(ying)盡量(liang)減少有高濃(nong)(nong)度的帶負電荷的基團， 例如磷酸(suan)基團或EDTA等可(ke)能影響(xiang)Mg2+ 離子濃(nong)(nong)度的物質，以(yi)保證最適Mg2+ 濃(nong)(nong)度。

6、 靶序列（DNA模板）
（1）PCR反應必須以DNA為模(mo)板(ban)進(jin)行擴增(zeng)， 模(mo)板(ban)DNA可以是單鏈分(fen)子，也(ye)(ye)可以是雙(shuang)鏈分(fen)子，可以是線狀分(fen)子，也(ye)(ye)可以是環狀分(fen)子(線狀分(fen)子比環狀分(fen)子的擴增(zeng)效(xiao)果稍好)。
（2）就模板(ban)DNA而言，影(ying)響PCR的主要因(yin)素是(shi)模板(ban)的數(shu)量(liang)和純度(du).一(yi)般反(fan)應中(zhong)的模板(ban)數(shu)量(liang)為102 -105 個拷(kao)貝，對于單(dan)拷(kao)貝基因(yin)，這(zhe)需(xu)要0.1μg的人基因(yin)組DNA，10ng的酵母(mu)DNA，1ng的大腸桿菌DNA.擴增多拷(kao)貝序列時，用量(liang)更少。
（3）靈敏的PCR可(ke)從(cong)一個細胞，一根頭發(fa)，一個孢子或一個精子提取(qu)的DNA中分析目的序列。
（4）模板量過(guo)多則可能增加非特異性產(chan)物(wu)。DNA中的雜(za)質也會影響PCR的效率。

注意事項：
1.PCR應該在沒有DNA污染(ran)的干凈環境中進(jin)行，最好(hao)設立一個專用(yong)的PCR配制室、模(mo)板室、擴增室，避免污染(ran)（16S）。
2.純化(hua)模板所選用的(de)方(fang)法對污染(ran)的(de)風(feng)險有極大(da)影響。一般(ban)而言，只要能夠得(de)到可靠(kao)的(de)結(jie)果，純化(hua)的(de)方(fang)法越(yue)(yue)簡單(dan)越(yue)(yue)好。
3.所有試劑都(dou)應該沒有核酸和(he)核酸酶的污染，操作(zuo)過程中均應戴手套。
4.PCR試(shi)劑配制應使(shi)用最高(gao)(gao)質量的(de)新(xin)鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高(gao)(gao)溫高(gao)(gao)壓(ya)滅菌。5.試(shi)劑都應該以大體(ti)積配制，然后分裝成僅夠一(yi)次(ci)使(shi)用的(de)量儲存，從而確保實驗與實驗之(zhi)間的(de)連(lian)續性(xing)與平行性(xing)。
6.試(shi)劑或樣品準(zhun)備(bei)過(guo)程中都要(yao)使用(yong)滅(mie)菌的tubes和tips，玻(bo)璃器皿應洗滌干凈并高壓滅(mie)菌。
7.PCR配制試劑(ji)應(ying)在冰上融化，并(bing)且要瞬(shun)離(li)并(bing)充分混勻。