ELISA試驗出現“花板”現象探究

      酶聯免疫吸(xi)附試(shi)驗(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay， ELISA)在(zai)生物實(shi)驗技術中，ELISA是一種非(fei)常(chang)常(chang)見(jian)的分析方法。其原理(li)是(shi)抗原或(huo)抗體的(de)(de)(de)固相化及抗原抗體的(de)(de)(de)酶標(biao)記。加入酶反應(ying)(ying)的(de)(de)(de)底(di)物后，底(di)物被酶催化成為有色產物，產物的(de)(de)(de)量(liang)(liang)與(yu)標(biao)本(ben)中受檢物質的(de)(de)(de)量(liang)(liang)直接(jie)相關，由此(ci)進行定性(xing)或(huo)定量(liang)(liang)分析。該(gai)實驗(yan)因其靈敏度較高，特(te)異性(xing)較好，操作(zuo)較簡單，可(ke)大批量(liang)(liang)操作(zuo)而廣泛應(ying)(ying)用(yong)于多種傳染性(xing)疾病的(de)(de)(de)篩查工作(zuo)中。而在進行ELISA實驗(yan)的過程中，有時會遇到一(yi)種被稱為“花板(ban)”的現(xian)象(xiang)。

    “花(hua)板”現象，顧名思義，是(shi)指(zhi)在進行(xing)ELISA實驗(yan)時，酶標板上(shang)的(de)反應(ying)孔(kong)出現了(le)不均勻(yun)的(de)顏色分布，使得(de)孔(kong)內的(de)顏色看起來像是(shi)“花(hua)”一樣。所謂(wei)“花板”，就(jiu)是空白、陰性(xing)、陽(yang)(yang)性(xing)對照及(ji)室內(nei)質(zhi)控(kong)孔結果正(zheng)常(chang)，而標本孔的OD值(zhi)卻偏高(gao)，弱(ruo)陽(yang)(yang)性(xing)結果較多。這一現象(xiang)的出現，影響了實驗(yan)結(jie)果的準(zhun)確性(xing)，往往是由于實驗(yan)過程中(zhong)的某些操(cao)作不(bu)當(dang)或試(shi)劑的問題所導致(zhi)的。對“花(hua)板”現象進行了(le)分析和總結，認(ren)為花(hua)板原因大多在(zai)樣品，解決辦(ban)法主要在(zai)洗滌，孵育和顯色過程也(ye)會導(dao)致。

1、花(hua)板原因大多在樣(yang)品
　　所謂“花板”，就(jiu)是(shi)空白、陰陽性(xing)對照及室內質(zhi)(zhi)控(kong)孔結(jie)果(guo)(guo)正常(chang)(chang)，而標(biao)(biao)本孔的OD值(zhi)卻偏(pian)高。之所(suo)以空白、對照及質(zhi)(zhi)控(kong)結(jie)果(guo)(guo)正常(chang)(chang)而標(biao)(biao)本孔異常(chang)(chang)，是(shi)因為樣品本身的原因，大部分(fen)或全(quan)部標(biao)(biao)本孔的OD值(zhi)偏(pian)高，很(hen)可能是(shi)因為樣品中某些共有的物質(zhi)(zhi)非(fei)特異性(xing)的吸(xi)附于固相載體，而在實驗(yan)的過(guo)程(cheng)中未(wei)被(bei)除去。

1.1、 待(dai)測血清(qing)中混(hun)有(you)紅(hong)(hong)細胞(bao)(bao)或(huo)纖維蛋(dan)(dan)白(bai)原 這兩種物質(zhi)(zhi)易(yi)沉淀或(huo)附著在(zai)聚(ju)乙烯孔內不易(yi)洗凈，實驗(yan)表(biao)明在(zai)較(jiao)(jiao)高(gao)的(de)離(li)心轉速(su)(3000 /min)和較(jiao)(jiao)長的(de)離(li)心時間(jian)(>10 min)之(zhi)(zhi)下(xia)，血液標本被充(chong)分地離(li)心分離(li)之(zhi)(zhi)后，使紅(hong)(hong)細胞(bao)(bao)和纖維蛋(dan)(dan)白(bai)充(chong)分沉淀，可以在(zai)加樣時避免(mian)(mian)加入紅(hong)(hong)細胞(bao)(bao)和纖維蛋(dan)(dan)白(bai)，避免(mian)(mian)這兩種干擾物質(zhi)(zhi)對實驗(yan)結果的(de)影響，就可避免(mian)(mian)“花(hua)板”情況。

1.2、 高(gao)IgG血癥 在實際工作中，筆者(zhe)發現(xian)(xian)，檢測(ce)丙肝(gan)的(de)(de)實驗(yan)出(chu)現(xian)(xian)花板的(de)(de)情況較多，原因之一(yi)是(shi)因為目前國內外的(de)(de)抗(kang)-HCV EIA試劑均采(cai)用間接(jie)酶聯(lian)免疫(yi)檢測(ce)原理，間接(jie)法的(de)(de)一(yi)個重(zhong)要影響因素是(shi)血清中所含(han)的(de)(de)高濃(nong)度的(de)(de)非(fei)特異(yi)性IgG，IgG對聚(ju)苯乙烯有較強的(de)(de)吸附力，非(fei)特異(yi)性IgG可(ke)吸附到固相(xiang)載體上或包被的(de)(de)抗(kang)原上造成假陽(yang)性。

2、解決辦法主要在洗滌
　　聚苯(ben)乙烯(xi)因其(qi)具有較(jiao)強的吸附蛋白質的性能而被(bei)廣泛用于ELISA實(shi)驗(yan)(yan)的固(gu)相(xiang)載體，聚苯(ben)乙(yi)烯等塑料對蛋白(bai)質的吸附是普遍性(xing)的，因此需(xu)要通過洗(xi)滌(di)清(qing)除(chu)在(zai)反應過程(cheng)中非特異(yi)(yi)性(xing)地(di)吸附于固(gu)相(xiang)載體的干擾物質。洗(xi)滌(di)在(zai) ELISA 過程(cheng)中雖不是一個反應步(bu)驟(zou)，但卻決(jue)定著實(shi)驗(yan)(yan)的成敗(bai)。上述提到的血清(qing)中存在(zai)紅細胞或(huo)纖維蛋白(bai)原，可以在(zai)加樣(yang)前(qian)離心時得到控制(zhi)，同樣(yang)也(ye)可以通過適當增加洗(xi)滌(di)次數和浸泡時間(jian)減輕(qing)或(huo)避(bi)免對實(shi)驗(yan)(yan)結果的影響(xiang)，同樣(yang)，對于血液存在(zai)的非特異(yi)(yi)性(xing)的IgG,實(shi)驗(yan)(yan)者很難在(zai)加樣(yang)時將其去除(chu)，那(nei)么解決(jue)的最佳時機就是洗(xi)滌(di)過程(cheng)。

ELISA在洗(xi)滌過程中需注意(yi)以下(xia)幾點：

(1) 、板(ban)要(yao)平整，尤其是(shi)在用洗板(ban)機洗板(ban)的過(guo)程(cheng)中，往(wang)往(wang)是(shi)3排(pai)一起洗，如果板(ban)不(bu)平，就(jiu)很可能(neng)造(zao)成(cheng)洗液有殘留，從而導致非特異性結合不(bu)能(neng)清除干凈，對實驗結果造(zao)成(cheng)干擾。

(2) 、洗液(ye)溫度，實驗表明，洗液(ye)溫度也會(hui)影(ying)響洗板(ban)的干凈(jing)程度，尤(you)其是冬(dong)天溫度過(guo)低時容易出現“花板”問題。因此，最(zui)好保持室溫在20℃-30℃。

(3) 、洗液(ye)要注(zhu)滿孔，孔壁洗滌不干(gan)凈也易造成(cheng)“花板”現象(xiang)。

(4) 、洗液要新鮮(xian)配(pei)置，洗液要臨用(yong)前新鮮(xian)配(pei)制，放置時(shi)間過(guo)長(chang)易產生絮狀物或(huo)混濁，造成賭(du)孔或(huo)花板。

(5)、洗板次數不夠或(huo)洗滌間(jian)隔(ge)時間(jian)過短(duan)也會造(zao)成由(you)于洗板不凈而造(zao)成“花板”。

3、孵育時(shi)間過長(chang)也會造成“花板”
　　本實(shi)驗室曾有一段時間經常出(chu)現丙肝檢測(ce)“花板”現(xian)象，究其原(yuan)因是由(you)于樣(yang)本較(jiao)多，加(jia)樣(yang)后未及(ji)時(shi)(shi)(shi)放入孵(fu)育箱(xiang)，反應板在室溫呆的時(shi)(shi)(shi)間(jian)過長，即間(jian)接(jie)增加(jia)了孵(fu)育時(shi)(shi)(shi)間(jian)，導(dao)致孵(fu)育時(shi)(shi)(shi)間(jian)過長，蛋(dan)白(bai)質(zhi)非(fei)特異(yi)性吸附于固相載(zai)體。因此，應嚴格控(kong)制加(jia)樣(yang)時(shi)(shi)(shi)間(jian)，加(jia)樣(yang)后及(ji)時(shi)(shi)(shi)孵(fu)育，標本較(jiao)多時(shi)(shi)(shi)可分批操作。
　　此外(wai)，有些廠家的(de)試劑(ji)顯色液不(bu)穩定，使用前容易變藍，如在實驗前不(bu)仔細檢查，很容易導致“花板”現象的(de)發生，這(zhe)也(ye)提醒實(shi)(shi)驗(yan)者應使用新鮮的(de)顯色液，大(da)程度(du)的(de)保證實(shi)(shi)驗(yan)的(de)準確性。
　　綜上(shang)所述(shu)，將ELISA“花(hua)(hua)板”現象(xiang)總結為(wei)：花(hua)(hua)板原因大(da)多在樣(yang)(yang)品，解決辦法(fa)(fa)主(zhu)要(yao)在洗(xi)滌(di)，孵育(yu)和顯(xian)色過程也會(hui)導致(zhi)。既然原因大(da)多在樣(yang)(yang)品，那么在樣(yang)(yang)品交接時應(ying)嚴格按照規定(ding)(ding)，無(wu)溶(rong)血(xue)，無(wu)凝(ning)血(xue)，足量，單(dan)個(ge)的(de)(de)(de)(de)溶(rong)血(xue)樣(yang)(yang)品雖不致(zhi)造成“花(hua)(hua)板”，但血(xue)紅(hong)(hong)蛋(dan)白(bai)中的(de)(de)(de)(de)血(xue)紅(hong)(hong)素基團，具(ju)有(you)(you)類(lei)過氧(yang)化物(wu)的(de)(de)(de)(de)活性(xing)，在以辣根過氧(yang)化物(wu)酶(mei)(horseradish peroxidase,HRP)為(wei)標(biao)記(ji)酶(mei)的(de)(de)(de)(de)ELISA測(ce)定(ding)(ding)中，易(yi)在孵育(yu)過程中吸附于固相，從(cong)(cong)而與后面加入(ru)的(de)(de)(de)(de)底(di)物(wu)反應(ying)顯(xian)色，從(cong)(cong)而造成假陽性(xing)。洗(xi)滌(di)是(shi)(shi)ELISA的(de)(de)(de)(de)關鍵步驟，充分(fen)有(you)(you)效的(de)(de)(de)(de)洗(xi)滌(di)也是(shi)(shi)避(bi)免“花(hua)(hua)板”的(de)(de)(de)(de)有(you)(you)利(li)措(cuo)施(shi)(shi)。同樣(yang)(yang)，嚴格按照試劑說明(ming)孵育(yu)，使用新鮮的(de)(de)(de)(de)顯(xian)色液也是(shi)(shi)有(you)(you)效避(bi)免“花(hua)(hua)板”的(de)(de)(de)(de)保障。以上(shang)措(cuo)施(shi)(shi)可以有(you)(you)效減少“花(hua)(hua)板”次數，從(cong)(cong)而提(ti)高檢(jian)測(ce)的(de)(de)(de)(de)特異性(xing)和準確性(xing)，更好的(de)(de)(de)(de)發(fa)揮ELISA的(de)(de)(de)(de)方(fang)法(fa)(fa)學(xue)優勢。