ELISA測定實際溫育操作配置揭秘

     在ELISA中一般有(you)兩次抗(kang)原(yuan)抗(kang)體反應(ying)，即(ji)加(jia)樣本和加(jia)酶結(jie)合(he)物后。抗(kang)原(yuan)抗(kang)體反應(ying)的完(wan)成需要(yao)有(you)一定(ding)的溫(wen)度和時間，這一保溫(wen)過程稱(cheng)為溫育(incubation)，有人稱之為孵育。 

 一、溫育的時間配置：

溫育這一步是ELISA測定中最容易出現問題的步驟。目前市面上的商品化試劑盒的反應溫育時間一般為30~120分鐘，溫育時間若不夠，可能會影響測定下限。

ELISA屬(shu)固(gu)相免(mian)疫(yi)測定(ding)，抗原(yuan)、抗體的(de)(de)(de)結合(he)只在(zai)固(gu)相表面上發生。以抗體包被的(de)(de)(de)夾心法為例，加(jia)入板孔中的(de)(de)(de)標(biao)本，其(qi)中的(de)(de)(de)抗原(yuan)并不是都(dou)有(you)均等的(de)(de)(de)和固(gu)相抗結合(he)的(de)(de)(de)機會，只有(you)最(zui)貼近孔壁的(de)(de)(de)一(yi)(yi)層溶液(ye)中的(de)(de)(de)抗原(yuan)直接(jie)與(yu)抗體接(jie)觸。這(zhe)是一(yi)(yi)個逐步平衡(heng)的(de)(de)(de)過(guo)程(cheng)，因此需(xu)(xu)經擴散才(cai)能達到(dao)反(fan)(fan)應的(de)(de)(de)終(zhong)點。在(zai)其(qi)后加(jia)入的(de)(de)(de)酶標(biao)記抗體與(yu)固(gu)相抗原(yuan)的(de)(de)(de)結合(he)也同樣(yang)如此。這(zhe)就是為什么ELISA反(fan)(fan)應總是需(xu)(xu)要(yao)一(yi)(yi)定(ding)時間(jian)的(de)(de)(de)溫育。

在一定(ding)溫(wen)(wen)度范圍內，溫(wen)(wen)育所(suo)需時間與(yu)溫(wen)(wen)度成(cheng)反比(bi)，即溫(wen)(wen)度越(yue)高，則所(suo)需時間相對較短。

二、溫育的溫度配置：

溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中(zhong)常用的保溫溫度，也(ye)是大多(duo)數抗原(yuan)抗體結合的合適溫度。

在建立ELISA方法作反應動力學研究時，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時，產物的生成可達頂峰。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應4℃更為徹底，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜，以形成最多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用。

三、 溫育的保溫配置：

溫(wen)育(yu)方式常采用溫(wen)箱法(fa)(fa)(fa)、微波輻射法(fa)(fa)(fa)和水浴(yu)法(fa)(fa)(fa)。其中水浴(yu)法(fa)(fa)(fa)能較好解決因(yin)受(shou)熱不均衡所致(zhi)的(de)周圍孔與中央孔結果的(de)吸光度差(cha)異（“邊緣效應”即外周孔顯色較中心孔深）。可將ELISA板置于水浴箱中，板底應貼著水面，使溫度迅速平衡，為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。

若用溫箱，ELISA板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料（如金屬等），在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此。為避免酶標板底部受水汽或磨損導致的讀數誤差，一般采用鼓風恒溫箱保溫，這個過程必須在酶標板上方貼封紙，以免蒸發。

無論是(shi)(shi)水浴還是(shi)(shi)濕盒溫育，反應板均不宜疊(die)放，以保證各板的溫度都(dou)能迅速平衡。室(shi)溫溫育(yu)的反應(ying)，操作時(shi)的室(shi)溫應(ying)嚴格限制在規定的范圍內(nei)，標準室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可(ke)根據說明書(shu)的要求控制溫(wen)育。

室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確。為保證時間精確，一個人一次不宜多于兩塊板同時操作、測定。

 關于溫(wen)育，在實際測定操(cao)作中(zhong)應注意：

1、 不同的溫育環(huan)境對檢測結果有影響(xiang)，操作(zuo)中應嚴(yan)格按照(zhao)說明書控制溫育時間及溫度，并注意封閉避(bi)免邊緣效應。

2、  為確保各板溫度都能迅速達到平衡，不可將反應板疊加放置，設定的溫度及時間嚴格按照說明書進行，一般加入待測樣本后使其與固相抗原(抗體)置于37℃環境下溫育。因為很多恒溫箱的構造，溫度及檢測的溫度并非酶標板溫育溫度，所以使用恒溫箱溫育時建議將溫度計置于酶標板旁，保證酶標板旁溫度為37℃。

3、 干育和水溫(wen)的影響差異較為明(ming)顯(xian)，建議(yi)使用水溫(wen)，注意將固相板放(fang)入(ru)水中，防止受熱不(bu)均(jun)勻。

4、試劑盒一般設定的反應溫度為 37℃，在這個溫度下放置 30 分鐘，蒸騰的水分會許多，對于全部反應體系來講，各種反應物的濃度會不斷增加，這么必會致使反應最終的OD值增加，溫育時貼封片或加蓋，避免標本或稀釋液蒸發。 

5、試劑盒設定(ding)的(de)(de)一定(ding)溫度(du)(du)下的(de)(de)反(fan)(fan)應(ying)時間(jian)并不是反(fan)(fan)應(ying)的(de)(de)終點，提高反(fan)(fan)應(ying)的(de)(de)溫度(du)(du)，會(hui)加速反(fan)(fan)應(ying)，一樣(yang)(yang)延(yan)長時間(jian)會(hui)影(ying)響反(fan)(fan)應(ying)，這樣(yang)(yang)得(de)到(dao)的(de)(de)反(fan)(fan)應(ying)程(cheng)度(du)(du)會(hui)比試劑盒斷(duan)定(ding)的(de)(de)反(fan)(fan)應(ying)程(cheng)度(du)(du)深(shen)，也會(hui)引起(qi)陰性高值或假陽性。

     實驗操作(zuo)的(de)嚴謹性(xing)與實驗操作(zuo)規范密不可分(fen)，未使(shi)用(yong)的(de)試(shi)劑(ji)應(ying)儲(chu)存于2-8℃，使(shi)用(yong)時應(ying)回溫到室溫（20-25℃）。切忌不同批次的(de)試(shi)劑(ji)混合使(shi)用(yong)，要經常檢查酶標(biao)儀和(he)微量移液器(qi)的(de)精度和(he)準備度…… ELISA看起(qi)來(lai)很簡(jian)單，但是(shi)在(zai)實(shi)際(ji)操作過程(cheng)中，絕不能(neng)掉以輕心，除了嚴(yan)謹規范的實(shi)驗操作，高品質(zhi)的試劑盒與專業的技(ji)術團(tuan)隊也是(shi)獲得(de)準確結果的保證！