ELISA測定實際溫育操作配置揭秘

     在ELISA中一般(ban)有兩次抗原(yuan)抗體反應(ying)(ying)，即加(jia)樣(yang)本和(he)加(jia)酶結合物(wu)后(hou)。抗原(yuan)抗體反應(ying)(ying)的(de)完成(cheng)需要有一定的(de)溫度(du)和(he)時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育。 

 一、溫育的時間配置：

溫育這一步是ELISA測定中最容易出現問題的步驟。目前市面上的商品化試劑盒的反應溫育時間一般為30~120分鐘，溫育時間若不夠，可能會影響測定下限。

ELISA屬(shu)固(gu)(gu)相(xiang)免疫測定(ding)，抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)、抗(kang)(kang)(kang)體(ti)的(de)(de)結(jie)合(he)只在固(gu)(gu)相(xiang)表(biao)面(mian)上發生。以抗(kang)(kang)(kang)體(ti)包被的(de)(de)夾心(xin)法為(wei)例(li)，加(jia)入(ru)板孔中的(de)(de)標(biao)本，其中的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)并不是(shi)(shi)都有(you)均等的(de)(de)和固(gu)(gu)相(xiang)抗(kang)(kang)(kang)結(jie)合(he)的(de)(de)機會，只有(you)最貼近孔壁(bi)的(de)(de)一層溶(rong)液中的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)直接(jie)與抗(kang)(kang)(kang)體(ti)接(jie)觸。這是(shi)(shi)一個(ge)逐步(bu)平衡的(de)(de)過(guo)程，因(yin)此(ci)需(xu)經擴(kuo)散才能達到反應(ying)的(de)(de)終點。在其后加(jia)入(ru)的(de)(de)酶標(biao)記抗(kang)(kang)(kang)體(ti)與固(gu)(gu)相(xiang)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)(yuan)的(de)(de)結(jie)合(he)也(ye)同樣如(ru)此(ci)。這就是(shi)(shi)為(wei)什(shen)么(me)ELISA反應(ying)總是(shi)(shi)需(xu)要一定(ding)時間的(de)(de)溫育。

在一定溫度范圍內，溫育所需時(shi)間與(yu)溫度成反比，即溫度越高，則(ze)所需時(shi)間相對較短(duan)。

二、溫育的溫度配置：

溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是(shi)實(shi)驗室中常用的(de)保溫溫度(du)，也(ye)是(shi)大(da)多數抗原抗體(ti)結合的(de)合適溫度(du)。

在建立ELISA方法作反應動力學研究時，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時，產物的生成可達頂峰。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度。抗原抗體反應4℃更為徹底，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜，以形成最多的沉淀。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予采用。

三、 溫育的保溫配置：

溫育方式常采用溫箱法(fa)(fa)、微波輻(fu)射法(fa)(fa)和(he)水浴法(fa)(fa)。其中水浴法(fa)(fa)能較好解決因受熱不均衡所致(zhi)的(de)周圍孔(kong)與中央孔(kong)結果的(de)吸光(guang)度差異（“邊緣效應”即外周孔顯色較中心孔深）。可將ELISA板置于水浴箱中，板底應貼著水面，使溫度迅速平衡，為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。

若用溫箱，ELISA板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料（如金屬等），在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此。為避免酶標板底部受水汽或磨損導致的讀數誤差，一般采用鼓風恒溫箱保溫，這個過程必須在酶標板上方貼封紙，以免蒸發。

無論是(shi)水浴還是(shi)濕盒溫育(yu)，反(fan)應板均不宜疊放，以保證(zheng)各板的溫度(du)都能迅速平衡(heng)。室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規定的范圍內(nei)，標準室溫溫度是指20-25℃，但具(ju)體操作時可根據說明書的要求(qiu)控制溫育。

室溫溫育時，ELISA板只要平置于操作臺上即可。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求準確。為保證時間精確，一個人一次不宜多于兩塊板同時操作、測定。

 關(guan)于溫育，在實際測定(ding)操作中應注意：

1、 不同的溫育環(huan)境對檢測結果有影響，操作(zuo)中(zhong)應(ying)嚴格按照說明書控(kong)制溫育時間(jian)及溫度，并(bing)注意封閉避(bi)免邊緣效應(ying)。

2、  為確保各板溫度都能迅速達到平衡，不可將反應板疊加放置，設定的溫度及時間嚴格按照說明書進行，一般加入待測樣本后使其與固相抗原(抗體)置于37℃環境下溫育。因為很多恒溫箱的構造，溫度及檢測的溫度并非酶標板溫育溫度，所以使用恒溫箱溫育時建議將溫度計置于酶標板旁，保證酶標板旁溫度為37℃。

3、 干育和水溫的(de)影響差異較為(wei)明顯，建議使(shi)用(yong)水溫，注意將固相板放入水中(zhong)，防止受熱(re)不均勻。

4、試劑盒一般設定的反應溫度為 37℃，在這個溫度下放置 30 分鐘，蒸騰的水分會許多，對于全部反應體系來講，各種反應物的濃度會不斷增加，這么必會致使反應最終的OD值增加，溫育時貼封片或加蓋，避免標本或稀釋液蒸發。 

5、試(shi)劑(ji)(ji)盒設定(ding)的(de)一定(ding)溫度(du)(du)下(xia)的(de)反(fan)(fan)應(ying)時(shi)(shi)間并不(bu)是反(fan)(fan)應(ying)的(de)終點，提高(gao)反(fan)(fan)應(ying)的(de)溫度(du)(du)，會(hui)加速反(fan)(fan)應(ying)，一樣延長時(shi)(shi)間會(hui)影響反(fan)(fan)應(ying)，這樣得到的(de)反(fan)(fan)應(ying)程(cheng)(cheng)度(du)(du)會(hui)比試(shi)劑(ji)(ji)盒斷定(ding)的(de)反(fan)(fan)應(ying)程(cheng)(cheng)度(du)(du)深，也會(hui)引(yin)起(qi)陰性(xing)高(gao)值或假陽性(xing)。

     實驗操作(zuo)的(de)嚴(yan)謹性(xing)與(yu)實驗操作(zuo)規范密(mi)不(bu)可分(fen)，未使用(yong)(yong)的(de)試劑應(ying)儲存于2-8℃，使用(yong)(yong)時應(ying)回溫(wen)(wen)到室(shi)溫(wen)(wen)（20-25℃）。切忌(ji)不(bu)同批次的(de)試劑混(hun)合使用(yong)(yong)，要經常檢查酶標(biao)儀和(he)微(wei)量(liang)移液(ye)器的(de)精(jing)度和(he)準(zhun)備度…… ELISA看(kan)起來(lai)很簡(jian)單，但是在實際操作過(guo)程中，絕(jue)不能(neng)掉以輕心，除了嚴謹規范(fan)的(de)(de)實驗操作，高品質(zhi)的(de)(de)試劑盒(he)與專業(ye)的(de)(de)技(ji)術團隊也是獲得準確結(jie)果的(de)(de)保證！