熒光定量PCR（Rt-PCR）實驗中各環節使用哪些對照？

      熒光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR擴(kuo)增(zeng)反應體(ti)系(xi)中加(jia)入熒(ying)(ying)光(guang)基(ji)團，通過對(dui)擴(kuo)增(zeng)反應中每一(yi)個循環(huan)產(chan)物熒(ying)(ying)光(guang)信號(hao)的(de)實時(shi)檢(jian)測(ce),最后通過標準曲線(xian)對(dui)未知模板進行(xing)(xing)定量分析的(de)方法(fa)。對(dui)照的(de)目的(de)是對(dui)檢(jian)測(ce)的(de)各個環(huan)節進行(xing)(xing)監控(kong)，因此(ci)我們按照檢(jian)測(ce)的(de)流程對(dui)對(dui)照進行(xing)(xing)梳理(li)。常(chang)規熒(ying)(ying)光(guang)定量PCR的(de)流程是：樣(yang)品采(cai)集-運(yun)輸-樣(yang)品處理(li)-核酸提取-反轉錄(lu)（RNA病毒）-擴(kuo)增(zeng)-結果讀取。下(xia)面(mian)看看各個環(huan)節都可以使用哪些對(dui)照？

1、陽性對照和陰性對照
陽性對照和陰性對照是指在相同的處理條件下，比如一份已知的感染樣品和一份已知的未感染樣品，都進行了提取和擴增最終獲得了陽性結果和陰性結果。陰陽性對照強調處理過程與樣品一致，并且有明確的預期結果。

2.擴增對照
我們通常說的陽性對照和陰性對照指的是擴增試劑盒中附帶的不需要提取的陽性對照和陰性對照，更準確的定義應該是擴增陽性對照和擴增陰性對照。擴增陽性對照含有陽性擴增模板，擴增陰性對照應含有陰性擴增模板（基質核酸）。擴增對照只能監控每次擴增過程中的擴增系統是否正常，不能監控采樣、提取和每份樣品的操作過程。如果是檢測RNA樣品的檢測試劑盒，其擴增陽性對照使用質粒，便無法監控反轉錄過程。

3、內標（Internal Control，IC）
內標是指在同一反應管中與靶序列共同擴增的一段非靶序列分子。內標有兩種形式，一種是使用天然樣品中含有的內參基因作為內標，另一種是人工添加的內標。內標的最大特點是與靶序列共同擴增，而其他的對照都是獨立擴增。

3.1 內參基因
通常它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測基因的表達水平變化時常用它來做參照物。內參基因通常是持家基因（house-keeping gene）因為其表達水平受環境因素影響較小，而且在個體各個生長階段的幾乎全部組織中持續表達變化很小。常用的內參基因包括GAPDH、β-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。
內參(can)(can)基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)優點(dian)是與樣(yang)品(pin)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)靶基(ji)因(yin)經歷全相同(tong)的(de)(de)(de)(de)處理(li)(li)程序(xu)，可以(yi)監(jian)控采樣(yang)，運輸，核酸提(ti)取和擴增(zeng)的(de)(de)(de)(de)全部過程。缺點(dian)是不(bu)(bu)同(tong)物種，不(bu)(bu)同(tong)生理(li)(li)狀態下，不(bu)(bu)同(tong)組織中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)內參(can)(can)基(ji)因(yin)存在一(yi)定(ding)的(de)(de)(de)(de)差異。如(ru)果樣(yang)品(pin)類型是口腔液，咽拭子等樣(yang)品(pin)，內參(can)(can)基(ji)因(yin)的(de)(de)(de)(de)量很低可能(neng)導致實驗不(bu)(bu)成立。如(ru)果檢測的(de)(de)(de)(de)是環境樣(yang)品(pin)則(ze)內參(can)(can)基(ji)因(yin)可能(neng)全失效。

3.2人工內標
添加一種不會干擾靶序列擴增的人工合成的內標。現在國外的診斷試劑盒大部分都會將內標直接添加在反應液中與模板一起擴增，但是這樣的內標不能監控采樣，運輸和核酸提取的過程。

還有另一種形式的內標，使用人工合成的假病毒，在核酸提取前在每一份樣品中加入等量的內標，這樣就可以監控樣品的提取到擴增的過程。但是由于是人工添加到樣品中，仍然不能監控胞內細菌病毒的釋放情況。

4、核酸提取對照
可以使用內參基因，假病毒混合基質，滅活病毒混合基質來監控提取到擴增的流程。

5、反轉錄對照（RT control）
可以使用提取好的RNA內參基因，RNA假病毒混合基質，滅活RNA病毒混合基質來監控反轉錄到擴增的流程。
無反轉錄對照（no-RT control）含有除反轉錄酶以外的所有成分。

6、空白對照（Blank control）
6.1無模板空白對照
NTC是指不含有模板（陽性模板或者陰性模板）的對照。目前的試劑盒的NC一般都是水或陰性緩沖液，所以NC等同于NTC。其實兩者有不同的作用。

6.2儀器空白對照
NTC是含有引物探針和反應液主要監控引物探針，反應體系有沒有被污染。這里的儀器空白對照我通常使用的是空反應管來監控儀器有無非特異性的熒光信號。

6.3熒光染料對照
最常使用的是ROX染料，由于熒光定量PCR的熒光信號在每個樣品孔會有微小的差異所以使用特定的ROX熒光染料，系統可以根據ROX熒光染料的信號值來校準每孔的熒光信號。

7、質控品（Quality control, QC）
上述環節中使用的各種對照大部分是試劑廠家匹配試劑盒使用的產品，有的是實驗室自制，所以整個的監控過程可能存在不夠客觀和獨立。因此在實驗室的對照設置中每次檢測都建議使用第三方質控品，有條件的使用國家有證標準物質(Reference material ,RM)。由于標準物質具有準確量值和計量溯源性，可以更準確的評估整個試驗流程的準確度。

8、定值參考品

醫學(xue)上的定量檢(jian)測(ce)(ce)試(shi)劑(ji)盒(he)，需要(yao)配套定值參(can)考品用(yong)于試(shi)劑(ji)盒(he)的定量檢(jian)測(ce)(ce)使用(yong)。熒光定量PCR（Real-time PCR），是(shi)指在PCR擴(kuo)(kuo)增(zeng)反(fan)應體系中(zhong)加入熒(ying)光基團，通過(guo)對擴(kuo)(kuo)增(zeng)反(fan)應中(zhong)每一個循環產物熒(ying)光信號的實時(shi)檢測,最后(hou)通過(guo)標準曲線對未知模板進行定(ding)量分析的方法(fa)。

對照的目的是對檢測的各個環節進行監控，因此我們按照檢測的流程對對照進行梳理。
常規熒光定量PCR的流(liu)程(cheng)是：樣(yang)品采集-運輸-樣(yang)品處理(li)-核酸提取-反轉錄（RNA病毒）-擴增-結果讀取。下面看看各個(ge)環節都可以(yi)使用哪些(xie)對(dui)照？

1、陽性對照和陰性對照
陽性對照和陰性對照是指在相同的處理條件下，比如一份已知的感染樣品和一份已知的未感染樣品，都進行了提取和擴增最終獲得了陽性結果和陰性結果。陰陽性對照強調處理過程與樣品一致，并且有明確的預期結果。

2.擴增對照
我們通常說的陽性對照和陰性對照指的是擴增試劑盒中附帶的不需要提取的陽性對照和陰性對照，更準確的定義應該是擴增陽性對照和擴增陰性對照。擴增陽性對照含有陽性擴增模板，擴增陰性對照應含有陰性擴增模板（基質核酸）。擴增對照只能監控每次擴增過程中的擴增系統是否正常，不能監控采樣、提取和每份樣品的操作過程。如果是檢測RNA樣品的檢測試劑盒，其擴增陽性對照使用質粒，便無法監控反轉錄過程。

3、內標（Internal Control，IC）
內標是指在同一反應管中與靶序列共同擴增的一段非靶序列分子。內標有兩種形式，一種是使用天然樣品中含有的內參基因作為內標，另一種是人工添加的內標。內標的最大特點是與靶序列共同擴增，而其他的對照都是獨立擴增。

3.1 內參基因
通常它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測基因的表達水平變化時常用它來做參照物。內參基因通常是持家基因（house-keeping gene）因為其表達水平受環境因素影響較小，而且在個體各個生長階段的幾乎全部組織中持續表達變化很小。常用的內參基因包括GAPDH、β-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。
內參(can)基因(yin)的(de)(de)優點(dian)是與樣(yang)(yang)品(pin)(pin)中的(de)(de)靶基因(yin)經歷(li)全(quan)相(xiang)同的(de)(de)處理程(cheng)序(xu)，可(ke)以(yi)監控(kong)采樣(yang)(yang)，運(yun)輸(shu)，核酸提取和擴增的(de)(de)全(quan)部(bu)過(guo)程(cheng)。缺點(dian)是不同物種，不同生理狀態下，不同組織中的(de)(de)內參(can)基因(yin)存在一定的(de)(de)差(cha)異。如(ru)果樣(yang)(yang)品(pin)(pin)類型是口腔液，咽拭子等樣(yang)(yang)品(pin)(pin)，內參(can)基因(yin)的(de)(de)量很(hen)低(di)可(ke)能導致實驗(yan)不成立。如(ru)果檢測的(de)(de)是環境樣(yang)(yang)品(pin)(pin)則內參(can)基因(yin)可(ke)能全(quan)失效。

3.2人工內標
添加一種不會干擾靶序列擴增的人工合成的內標。現在國外的診斷試劑盒大部分都會將內標直接添加在反應液中與模板一起擴增，但是這樣的內標不能監控采樣，運輸和核酸提取的過程。

還有另一種形式的內標，使用人工合成的假病毒，在核酸提取前在每一份樣品中加入等量的內標，這樣就可以監控樣品的提取到擴增的過程。但是由于是人工添加到樣品中，仍然不能監控胞內細菌病毒的釋放情況。

4、核酸提取對照
可以使用內參基因，假病毒混合基質，滅活病毒混合基質來監控提取到擴增的流程。

5、反轉錄對照（RT control）
可以使用提取好的RNA內參基因，RNA假病毒混合基質，滅活RNA病毒混合基質來監控反轉錄到擴增的流程。
無反轉錄對照（no-RT control）含有除反轉錄酶以外的所有成分。

6、空白對照（Blank control）
6.1無模板空白對照
NTC是指不含有模板（陽性模板或者陰性模板）的對照。目前的試劑盒的NC一般都是水或陰性緩沖液，所以NC等同于NTC。其實兩者有不同的作用。

6.2儀器空白對照
NTC是含有引物探針和反應液主要監控引物探針，反應體系有沒有被污染。這里的儀器空白對照我通常使用的是空反應管來監控儀器有無非特異性的熒光信號。

6.3熒光染料對照
最常使用的是ROX染料，由于熒光定量PCR的熒光信號在每個樣品孔會有微小的差異所以使用特定的ROX熒光染料，系統可以根據ROX熒光染料的信號值來校準每孔的熒光信號。

7、質控品（Quality control, QC）
上述環節中使用的各種對照大部分是試劑廠家匹配試劑盒使用的產品，有的是實驗室自制，所以整個的監控過程可能存在不夠客觀和獨立。因此在實驗室的對照設置中每次檢測都建議使用第三方質控品，有條件的使用國家有證標準物質(Reference material ,RM)。由于標準物質具有準確量值和計量溯源性，可以更準確的評估整個試驗流程的準確度。

8、定值參考品

醫學上的(de)(de)定量(liang)檢(jian)測(ce)試(shi)劑盒，需要配(pei)套定值參(can)考(kao)品用于試(shi)劑盒的(de)(de)定量(liang)檢(jian)測(ce)使用。熒光定量PCR（Real-time PCR），是指(zhi)在PCR擴增反應(ying)體系中加入(ru)熒光基團，通(tong)過(guo)對擴增反應(ying)中每一個循環產物(wu)熒光信號(hao)的實時(shi)檢(jian)測,最(zui)后通(tong)過(guo)標(biao)準曲線對未(wei)知模板進行定量分(fen)析的方法。

對照的目的是對檢測的各個環節進行監控，因此我們按照檢測的流程對對照進行梳理。
常規熒(ying)光(guang)定量PCR的流程是(shi)：樣品采集(ji)-運輸-樣品處理-核酸提取-反轉(zhuan)錄（RNA病毒）-擴(kuo)增-結(jie)果讀取。下面看(kan)看(kan)各個(ge)環節都可以(yi)使用哪些對(dui)照？

1、陽性對照和陰性對照
陽性對照和陰性對照是指在相同的處理條件下，比如一份已知的感染樣品和一份已知的未感染樣品，都進行了提取和擴增最終獲得了陽性結果和陰性結果。陰陽性對照強調處理過程與樣品一致，并且有明確的預期結果。

2.擴增對照
我們通常說的陽性對照和陰性對照指的是擴增試劑盒中附帶的不需要提取的陽性對照和陰性對照，更準確的定義應該是擴增陽性對照和擴增陰性對照。擴增陽性對照含有陽性擴增模板，擴增陰性對照應含有陰性擴增模板（基質核酸）。擴增對照只能監控每次擴增過程中的擴增系統是否正常，不能監控采樣、提取和每份樣品的操作過程。如果是檢測RNA樣品的檢測試劑盒，其擴增陽性對照使用質粒，便無法監控反轉錄過程。

3、內標（Internal Control，IC）
內標是指在同一反應管中與靶序列共同擴增的一段非靶序列分子。內標有兩種形式，一種是使用天然樣品中含有的內參基因作為內標，另一種是人工添加的內標。內標的最大特點是與靶序列共同擴增，而其他的對照都是獨立擴增。

3.1 內參基因
通常它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測基因的表達水平變化時常用它來做參照物。內參基因通常是持家基因（house-keeping gene）因為其表達水平受環境因素影響較小，而且在個體各個生長階段的幾乎全部組織中持續表達變化很小。常用的內參基因包括GAPDH、β-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。
內參(can)基因(yin)的(de)(de)優(you)點是(shi)(shi)(shi)與樣品(pin)(pin)中的(de)(de)靶基因(yin)經歷全相同的(de)(de)處理(li)程序，可以監控采樣，運輸，核酸提取和擴增的(de)(de)全部過(guo)程。缺點是(shi)(shi)(shi)不同物(wu)種(zhong)，不同生(sheng)理(li)狀(zhuang)態下，不同組織中的(de)(de)內參(can)基因(yin)存在一定的(de)(de)差(cha)異。如(ru)果(guo)樣品(pin)(pin)類(lei)型(xing)是(shi)(shi)(shi)口腔液，咽拭子等樣品(pin)(pin)，內參(can)基因(yin)的(de)(de)量(liang)很低(di)可能(neng)(neng)導致實(shi)驗不成(cheng)立(li)。如(ru)果(guo)檢測的(de)(de)是(shi)(shi)(shi)環境樣品(pin)(pin)則內參(can)基因(yin)可能(neng)(neng)全失效(xiao)。

3.2人工內標
添加一種不會干擾靶序列擴增的人工合成的內標。現在國外的診斷試劑盒大部分都會將內標直接添加在反應液中與模板一起擴增，但是這樣的內標不能監控采樣，運輸和核酸提取的過程。

還有另一種形式的內標，使用人工合成的假病毒，在核酸提取前在每一份樣品中加入等量的內標，這樣就可以監控樣品的提取到擴增的過程。但是由于是人工添加到樣品中，仍然不能監控胞內細菌病毒的釋放情況。

4、核酸提取對照
可以使用內參基因，假病毒混合基質，滅活病毒混合基質來監控提取到擴增的流程。

5、反轉錄對照（RT control）
可以使用提取好的RNA內參基因，RNA假病毒混合基質，滅活RNA病毒混合基質來監控反轉錄到擴增的流程。
無反轉錄對照（no-RT control）含有除反轉錄酶以外的所有成分。

6、空白對照（Blank control）
6.1無模板空白對照
NTC是指不含有模板（陽性模板或者陰性模板）的對照。目前的試劑盒的NC一般都是水或陰性緩沖液，所以NC等同于NTC。其實兩者有不同的作用。

6.2儀器空白對照
NTC是含有引物探針和反應液主要監控引物探針，反應體系有沒有被污染。這里的儀器空白對照我通常使用的是空反應管來監控儀器有無非特異性的熒光信號。

6.3熒光染料對照
最常使用的是ROX染料，由于熒光定量PCR的熒光信號在每個樣品孔會有微小的差異所以使用特定的ROX熒光染料，系統可以根據ROX熒光染料的信號值來校準每孔的熒光信號。

7、質控品（Quality control, QC）
上述環節中使用的各種對照大部分是試劑廠家匹配試劑盒使用的產品，有的是實驗室自制，所以整個的監控過程可能存在不夠客觀和獨立。因此在實驗室的對照設置中每次檢測都建議使用第三方質控品，有條件的使用國家有證標準物質(Reference material ,RM)。由于標準物質具有準確量值和計量溯源性，可以更準確的評估整個試驗流程的準確度。

8、定值參考品

醫(yi)學上的定(ding)量檢測(ce)試(shi)劑盒，需(xu)要配套(tao)定(ding)值參考品用于(yu)試(shi)劑盒的定(ding)量檢測(ce)使用。，是指(zhi)在(zai)PCR擴增反應體系中(zhong)加入熒(ying)光基團，通(tong)過對(dui)擴增反應中(zhong)每一個(ge)循環(huan)產物熒(ying)光信號(hao)的(de)實時檢(jian)測(ce),最(zui)后通(tong)過標(biao)準曲(qu)線對(dui)未知模板進(jin)行定(ding)量分析(xi)的(de)方法。對(dui)照(zhao)(zhao)的(de)目(mu)的(de)是對(dui)檢(jian)測(ce)的(de)各個(ge)環(huan)節進(jin)行監(jian)控，因此(ci)我們按照(zhao)(zhao)檢(jian)測(ce)的(de)流程(cheng)對(dui)對(dui)照(zhao)(zhao)進(jin)行梳(shu)理。常規熒(ying)光定(ding)量PCR的(de)流程(cheng)是：樣(yang)品采集-運(yun)輸-樣(yang)品處理-核(he)酸提取-反轉錄（RNA病毒(du)）-擴增-結(jie)果讀取。下面看看各個(ge)環(huan)節都可以使用哪些對(dui)照(zhao)(zhao)？

1、陽性對照和陰性對照
陽性對照和陰性對照是指在相同的處理條件下，比如一份已知的感染樣品和一份已知的未感染樣品，都進行了提取和擴增最終獲得了陽性結果和陰性結果。陰陽性對照強調處理過程與樣品一致，并且有明確的預期結果。

2.擴增對照
我們通常說的陽性對照和陰性對照指的是擴增試劑盒中附帶的不需要提取的陽性對照和陰性對照，更準確的定義應該是擴增陽性對照和擴增陰性對照。擴增陽性對照含有陽性擴增模板，擴增陰性對照應含有陰性擴增模板（基質核酸）。擴增對照只能監控每次擴增過程中的擴增系統是否正常，不能監控采樣、提取和每份樣品的操作過程。如果是檢測RNA樣品的檢測試劑盒，其擴增陽性對照使用質粒，便無法監控反轉錄過程。

3、內標（Internal Control，IC）
內標是指在同一反應管中與靶序列共同擴增的一段非靶序列分子。內標有兩種形式，一種是使用天然樣品中含有的內參基因作為內標，另一種是人工添加的內標。內標的最大特點是與靶序列共同擴增，而其他的對照都是獨立擴增。

3.1 內參基因
通常它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測基因的表達水平變化時常用它來做參照物。內參基因通常是持家基因（house-keeping gene）因為其表達水平受環境因素影響較小，而且在個體各個生長階段的幾乎全部組織中持續表達變化很小。常用的內參基因包括GAPDH、β-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。
內(nei)參(can)(can)基(ji)因(yin)的(de)(de)優點是(shi)(shi)與樣(yang)品中(zhong)的(de)(de)靶基(ji)因(yin)經歷全(quan)相同的(de)(de)處理程(cheng)序，可(ke)(ke)以監控采樣(yang)，運輸(shu)，核(he)酸提取和(he)擴增的(de)(de)全(quan)部過程(cheng)。缺點是(shi)(shi)不(bu)同物種，不(bu)同生理狀態下，不(bu)同組織中(zhong)的(de)(de)內(nei)參(can)(can)基(ji)因(yin)存在一定的(de)(de)差異。如果(guo)樣(yang)品類型是(shi)(shi)口腔(qiang)液，咽拭子等樣(yang)品，內(nei)參(can)(can)基(ji)因(yin)的(de)(de)量很低可(ke)(ke)能導致實驗不(bu)成立。如果(guo)檢測的(de)(de)是(shi)(shi)環境(jing)樣(yang)品則(ze)內(nei)參(can)(can)基(ji)因(yin)可(ke)(ke)能全(quan)失效。

3.2人工內標
添加一種不會干擾靶序列擴增的人工合成的內標。現在國外的診斷試劑盒大部分都會將內標直接添加在反應液中與模板一起擴增，但是這樣的內標不能監控采樣，運輸和核酸提取的過程。

還有另一種形式的內標，使用人工合成的假病毒，在核酸提取前在每一份樣品中加入等量的內標，這樣就可以監控樣品的提取到擴增的過程。但是由于是人工添加到樣品中，仍然不能監控胞內細菌病毒的釋放情況。

4、核酸提取對照
可以使用內參基因，假病毒混合基質，滅活病毒混合基質來監控提取到擴增的流程。

5、反轉錄對照（RT control）
可以使用提取好的RNA內參基因，RNA假病毒混合基質，滅活RNA病毒混合基質來監控反轉錄到擴增的流程。
無反轉錄對照（no-RT control）含有除反轉錄酶以外的所有成分。

6、空白對照（Blank control）
6.1無模板空白對照
NTC是指不含有模板（陽性模板或者陰性模板）的對照。目前的試劑盒的NC一般都是水或陰性緩沖液，所以NC等同于NTC。其實兩者有不同的作用。

6.2儀器空白對照
NTC是含有引物探針和反應液主要監控引物探針，反應體系有沒有被污染。這里的儀器空白對照我通常使用的是空反應管來監控儀器有無非特異性的熒光信號。

6.3熒光染料對照
最常使用的是ROX染料，由于熒光定量PCR的熒光信號在每個樣品孔會有微小的差異所以使用特定的ROX熒光染料，系統可以根據ROX熒光染料的信號值來校準每孔的熒光信號。

7、質控品（Quality control, QC）
上述環節中使用的各種對照大部分是試劑廠家匹配試劑盒使用的產品，有的是實驗室自制，所以整個的監控過程可能存在不夠客觀和獨立。因此在實驗室的對照設置中每次檢測都建議使用第三方質控品，有條件的使用國家有證標準物質(Reference material ,RM)。由于標準物質具有準確量值和計量溯源性，可以更準確的評估整個試驗流程的準確度。

8、定值參考品
醫學上的定(ding)(ding)量檢測(ce)試(shi)劑(ji)盒，需要配套(tao)定(ding)(ding)值參(can)考品用于試(shi)劑(ji)盒的定(ding)(ding)量檢測(ce)使用。