細胞傳代培養過程及傳代問題解析

       由于培養皿的(de)限制，細胞(bao)(bao)(bao)(bao)到達一定的(de)密(mi)度之后它的(de)生長(chang)速(su)度就會放緩，所(suo)以為了讓細胞(bao)(bao)(bao)(bao)保持在對數生長(chang)期，保持細胞(bao)(bao)(bao)(bao)旺(wang)盛(sheng)的(de)分裂(lie)能力。這(zhe)時候需要進行細胞(bao)(bao)(bao)(bao)傳代！
       細胞(bao)培(pei)(pei)(pei)養的(de)(de)雷(lei)比(bi)較的(de)(de)多，我遇到過比(bi)較的(de)(de)情況。這里可以做慢(man)(man)慢(man)(man)的(de)(de)分析和討論！先(xian)把基本的(de)(de)細胞(bao)培(pei)(pei)(pei)養的(de)(de)步驟貼(tie)出來(lai)！需(xu)要(yao)注意的(de)(de)是，懸浮(fu)細胞(bao)和貼(tie)壁細胞(bao)的(de)(de)傳代培(pei)(pei)(pei)養是不一(yi)樣的(de)(de)。
貼壁細胞傳代:
1：對(dui)(dui)于貼壁細胞(bao)來說，它需要把上清去(qu)(qu)掉，用(yong)1-2ML的(de)(de)PBS洗一(yi)下(xia)細胞(bao)，然后用(yong)槍吸去(qu)(qu)洗滌液，然后加(jia)入(ru)(ru)胰(yi)酶進行細胞(bao)消化。（加(jia)入(ru)(ru)1-2ML的(de)(de)PBS， 我(wo)是(shi)會(hui)貼壁加(jia)入(ru)(ru)到培(pei)養皿(min)的(de)(de)邊(bian)緣，不能直(zhi)接對(dui)(dui)著細胞(bao)加(jia)入(ru)(ru)PBS，容易把細胞(bao)都(dou)吹起(qi)來。這一(yi)步的(de)(de)目的(de)(de)是(shi)為了(le)去(qu)(qu)掉殘余(yu)的(de)(de)培(pei)養基的(de)(de)，殘余(yu)的(de)(de)培(pei)養基會(hui)含有(you)血清和(he)一(yi)些(xie)離(li)子(zi)等，不利于接下(xia)來的(de)(de)消化。此外，常見的(de)(de)是(shi)0.25%的(de)(de)胰(yi)酶。一(yi)般根據細胞(bao)皿(min)的(de)(de)大(da)小加(jia)入(ru)(ru)胰(yi)酶，對(dui)(dui)于10cm的(de)(de)dish，我(wo)會(hui)加(jia)入(ru)(ru)1ml的(de)(de)胰(yi)酶。）
2：放(fang)到37攝氏度培養箱30s-1min（我這(zhe)里(li)處理的(de)(de)是293T細胞(bao)，不同的(de)(de)細胞(bao)的(de)(de)消化時間是不一(yi)樣的(de)(de)，需要具體的(de)(de)去查(cha)一(yi)查(cha)，如果消化的(de)(de)好的(de)(de)細胞(bao)是會(hui)呈現流沙狀態(tai)的(de)(de)，上(shang)下晃動都會(hui)隨著移動的(de)(de)。）
3：加入(ru)含有血(xue)清(qing)的培養液終止(zhi)消化(hua)，用(yong)槍把培養液吹勻。（因為含有血(xue)清(qing)可以(yi)終止(zhi)胰酶的消化(hua)反(fan)應(ying)，用(yong)槍吹培養皿底是(shi)為了把殘(can)留(liu)在(zai)底部的細胞吹起來）
4：轉移到(dao)15ml的離(li)心管中，離(li)心，200g 5-10min(一般我是1000rpm離(li)心3min)
5：去掉(diao)上清(qing)液，然后用PBS 重懸細胞，加入的PBS的量(liang)是(shi)10ML。再次離(li)心，去掉(diao)上清(qing)。
6：加入(ru)適量的(de)培養(yang)基，把細胞重懸(xuan)，然后轉移到培養(yang)皿里面。放(fang)入(ru)到37攝氏度的(de)5%的(de)二氧化碳培養(yang)箱。
懸浮細胞傳代:
1：對于(yu)懸浮(fu)細胞，達到匯合(he)狀態時，懸浮(fu)培養的(de)細胞會(hui)聚集成團(tuan)塊(kuai)，轉動培養瓶時培養基會(hui)變得(de)渾濁。（GM12878非常(chang)典型，當然了，有的(de)細胞不會(hui)聚集成團(tuan)，比如說K562）
2：可以用臺盼藍(lan)溶液+自動細(xi)(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)(shu)器或血(xue)細(xi)(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)(shu)器，確(que)定細(xi)(xi)胞(bao)的(de)密(mi)度(du)，計(ji)算需要添加的(de)培(pei)養基體(ti)積，將(jiang)培(pei)養物(wu)稀(xi)釋(shi)至建議的(de)接(jie)種密(mi)度(du)。
3：一般是按(an)比例(li)稀釋(shi)一下培(pei)養(yang)基，然后繼(ji)續傳代(dai)。（我在傳K562的(de)(de)時候(hou)，是會1：4的(de)(de)比例(li)去傳代(dai)，保證細胞密度在1M/ML以下，能達到對數生長期，細胞處于旺盛的(de)(de)分(fen)裂期）
4：把(ba)細胞(bao)放入到37℃，5%的(de)二氧(yang)化碳(tan)培養箱中，進行(xing)培養

傳代問題解決方案:
1.傳代密度過高
一(yi)旦細(xi)胞(bao)養(yang)太久(jiu)至融合度過高（>90%）才傳代(dai)，容(rong)易(yi)使細(xi)胞(bao)產生老化(hua)現(xian)象(xiang)，甚至是堆(dui)疊，再(zai)消化(hua)細(xi)胞(bao)時不易(yi)吹打成(cheng)單(dan)顆(ke)細(xi)胞(bao)，即便再(zai)重新鋪盤傳代(dai)，細(xi)胞(bao)也(ye)無法(fa)回到(dao)原(yuan)本的特性(xing)了。（如：單(dan)層細(xi)胞(bao)，沒長滿就發生堆(dui)疊現(xian)象(xiang)）
解決方案:
盡量避免(mian)融合度過高(gao)，鏡下觀察融合度約達到80%即可傳代(dai)分(fen)盤(pan)。
細胞(bao)融合(he)度：在(zai)細胞(bao)培養(yang)中(zhong)指的(de)是細胞(bao)在(zai)培養(yang)表面（培養(yang)皿/瓶）所(suo)占的(de)比例。

2.傳代密度過低
哺乳動物貼壁培養(yang)細(xi)胞(bao)，若細(xi)胞(bao)培養(yang)到80-90%密(mi)度需要開(kai)始傳(chuan)(chuan)代，在(zai)傳(chuan)(chuan)代接種細(xi)胞(bao)密(mi)度過低(di)，細(xi)胞(bao)間距(ju)離太(tai)遠(yuan)，就無法在(zai)細(xi)胞(bao)間產(chan)(chan)生黏(nian)附及通信(xin)(xin)作用，幫助信(xin)(xin)號(hao)傳(chuan)(chuan)導并活(huo)化細(xi)胞(bao)；總體細(xi)胞(bao)量不足，分泌的生長因(yin)子濃度會不足以(yi)產(chan)(chan)生利(li)于生長的微環境，以(yi)上皆會造成增殖速度遲緩或細(xi)胞(bao)死(si)亡。
解決方案:
細胞(bao)傳代時，要進行準確的(de)細胞(bao)計數，確保鋪盤的(de)密度(du).