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細胞傳代培養過程及傳代問題解析

       由于培養皿的(de)限制,細胞(bao)(bao)(bao)(bao)到達一定的(de)密(mi)度之后它的(de)生長(chang)速(su)度就會放緩,所(suo)以為了讓細胞(bao)(bao)(bao)(bao)保持在對數生長(chang)期,保持細胞(bao)(bao)(bao)(bao)旺(wang)盛(sheng)的(de)分裂(lie)能力。這(zhe)時候需要進行細胞(bao)(bao)(bao)(bao)傳代!
       細胞(bao)培(pei)(pei)(pei)養的(de)(de)雷(lei)比(bi)較的(de)(de)多,我遇到過比(bi)較的(de)(de)情況。這里可以做慢(man)(man)慢(man)(man)的(de)(de)分析和討論!先(xian)把基本的(de)(de)細胞(bao)培(pei)(pei)(pei)養的(de)(de)步驟貼(tie)出來(lai)!需(xu)要(yao)注意的(de)(de)是,懸浮(fu)細胞(bao)和貼(tie)壁細胞(bao)的(de)(de)傳代培(pei)(pei)(pei)養是不一(yi)樣的(de)(de)。
貼壁細胞傳代:
1:對(dui)(dui)于貼壁細胞(bao)來說,它需要把上清去(qu)(qu)掉,用(yong)1-2ML的(de)(de)PBS洗一(yi)下(xia)細胞(bao),然后用(yong)槍吸去(qu)(qu)洗滌液,然后加(jia)入(ru)(ru)胰(yi)酶進行細胞(bao)消化。(加(jia)入(ru)(ru)1-2ML的(de)(de)PBS, 我(wo)是(shi)會(hui)貼壁加(jia)入(ru)(ru)到培(pei)養皿(min)的(de)(de)邊(bian)緣,不能直(zhi)接對(dui)(dui)著細胞(bao)加(jia)入(ru)(ru)PBS,容易把細胞(bao)都(dou)吹起(qi)來。這一(yi)步的(de)(de)目的(de)(de)是(shi)為了(le)去(qu)(qu)掉殘余(yu)的(de)(de)培(pei)養基的(de)(de),殘余(yu)的(de)(de)培(pei)養基會(hui)含有(you)血清和(he)一(yi)些(xie)離(li)子(zi)等,不利于接下(xia)來的(de)(de)消化。此外,常見的(de)(de)是(shi)0.25%的(de)(de)胰(yi)酶。一(yi)般根據細胞(bao)皿(min)的(de)(de)大(da)小加(jia)入(ru)(ru)胰(yi)酶,對(dui)(dui)于10cm的(de)(de)dish,我(wo)會(hui)加(jia)入(ru)(ru)1ml的(de)(de)胰(yi)酶。)
2:放(fang)到37攝氏度培養箱30s-1min(我這(zhe)里(li)處理的(de)(de)是293T細胞(bao),不同的(de)(de)細胞(bao)的(de)(de)消化時間是不一(yi)樣的(de)(de),需要具體的(de)(de)去查(cha)一(yi)查(cha),如果消化的(de)(de)好的(de)(de)細胞(bao)是會(hui)呈現流沙狀態(tai)的(de)(de),上(shang)下晃動都會(hui)隨著移動的(de)(de)。)
3:加入(ru)含有血(xue)清(qing)的培養液終止(zhi)消化(hua),用(yong)槍把培養液吹勻。(因為含有血(xue)清(qing)可以(yi)終止(zhi)胰酶的消化(hua)反(fan)應(ying),用(yong)槍吹培養皿底是(shi)為了把殘(can)留(liu)在(zai)底部的細胞吹起來)
4:轉移到(dao)15ml的離(li)心管中,離(li)心,200g 5-10min(一般我是1000rpm離(li)心3min)
5:去掉(diao)上清(qing)液,然后用PBS 重懸細胞,加入的PBS的量(liang)是(shi)10ML。再次離(li)心,去掉(diao)上清(qing)。
6:加入(ru)適量的(de)培養(yang)基,把細胞重懸(xuan),然后轉移到培養(yang)皿里面。放(fang)入(ru)到37攝氏度的(de)5%的(de)二氧化碳培養(yang)箱。
懸浮細胞傳代:
1:對于(yu)懸浮(fu)細胞,達到匯合(he)狀態時,懸浮(fu)培養的(de)細胞會(hui)聚集成團(tuan)塊(kuai),轉動培養瓶時培養基會(hui)變得(de)渾濁。(GM12878非常(chang)典型,當然了,有的(de)細胞不會(hui)聚集成團(tuan),比如說K562)
2:可以用臺盼藍(lan)溶液+自動細(xi)(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)(shu)器或血(xue)細(xi)(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)(shu)器,確(que)定細(xi)(xi)胞(bao)的(de)密(mi)度(du),計(ji)算需要添加的(de)培(pei)養基體(ti)積,將(jiang)培(pei)養物(wu)稀(xi)釋(shi)至建議的(de)接(jie)種密(mi)度(du)。
3:一般是按(an)比例(li)稀釋(shi)一下培(pei)養(yang)基,然后繼(ji)續傳代(dai)。(我在傳K562的(de)(de)時候(hou),是會1:4的(de)(de)比例(li)去傳代(dai),保證細胞密度在1M/ML以下,能達到對數生長期,細胞處于旺盛的(de)(de)分(fen)裂期)
4:把(ba)細胞(bao)放入到37℃,5%的(de)二氧(yang)化碳(tan)培養箱中,進行(xing)培養

傳代問題解決方案:
1.傳代密度過高

一(yi)旦細(xi)胞(bao)養(yang)太久(jiu)至融合度過高(>90%)才傳代(dai),容(rong)易(yi)使細(xi)胞(bao)產生老化(hua)現(xian)象(xiang),甚至是堆(dui)疊,再(zai)消化(hua)細(xi)胞(bao)時不易(yi)吹打成(cheng)單(dan)顆(ke)細(xi)胞(bao),即便再(zai)重新鋪盤傳代(dai),細(xi)胞(bao)也(ye)無法(fa)回到(dao)原(yuan)本的特性(xing)了。(如:單(dan)層細(xi)胞(bao),沒長滿就發生堆(dui)疊現(xian)象(xiang))
解決方案:
盡量避免(mian)融合度過高(gao),鏡下觀察融合度約達到80%即可傳代(dai)分(fen)盤(pan)。
細胞(bao)融合(he)度:在(zai)細胞(bao)培養(yang)中(zhong)指的(de)是細胞(bao)在(zai)培養(yang)表面(培養(yang)皿/瓶)所(suo)占的(de)比例。

2.傳代密度過低
哺乳動物貼壁培養(yang)細(xi)胞(bao),若細(xi)胞(bao)培養(yang)到80-90%密(mi)度需要開(kai)始傳(chuan)(chuan)代,在(zai)傳(chuan)(chuan)代接種細(xi)胞(bao)密(mi)度過低(di),細(xi)胞(bao)間距(ju)離太(tai)遠(yuan),就無法在(zai)細(xi)胞(bao)間產(chan)(chan)生黏(nian)附及通信(xin)(xin)作用,幫助信(xin)(xin)號(hao)傳(chuan)(chuan)導并活(huo)化細(xi)胞(bao);總體細(xi)胞(bao)量不足,分泌的生長因(yin)子濃度會不足以(yi)產(chan)(chan)生利(li)于生長的微環境,以(yi)上皆會造成增殖速度遲緩或細(xi)胞(bao)死(si)亡。
解決方案:
細胞(bao)傳代時,要進行準確的(de)細胞(bao)計數,確保鋪盤的(de)密度(du).

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