細胞傳代培養過程及傳代問題解析

       由于(yu)培養皿的限制，細(xi)(xi)胞(bao)(bao)到達一定的密(mi)度之后它(ta)的生(sheng)長速度就會放(fang)緩，所(suo)以為了讓(rang)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)保(bao)持(chi)在對數(shu)生(sheng)長期，保(bao)持(chi)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)旺盛的分(fen)裂能力(li)。這時(shi)候需(xu)要進(jin)行(xing)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)傳代！
       細胞(bao)培(pei)(pei)養的(de)(de)(de)雷(lei)比較(jiao)的(de)(de)(de)多，我遇到過比較(jiao)的(de)(de)(de)情(qing)況。這里可(ke)以做慢慢的(de)(de)(de)分析和討論(lun)！先把基(ji)本(ben)的(de)(de)(de)細胞(bao)培(pei)(pei)養的(de)(de)(de)步驟貼出來(lai)！需(xu)要注意的(de)(de)(de)是(shi)，懸浮細胞(bao)和貼壁細胞(bao)的(de)(de)(de)傳代(dai)培(pei)(pei)養是(shi)不一樣的(de)(de)(de)。
貼壁細胞傳代:
1：對于(yu)貼壁細(xi)(xi)胞(bao)來說，它(ta)需要把(ba)上清去(qu)掉(diao)，用1-2ML的(de)(de)(de)PBS洗一(yi)下細(xi)(xi)胞(bao)，然后用槍吸(xi)去(qu)洗滌液(ye)，然后加(jia)(jia)(jia)入胰酶(mei)(mei)進行細(xi)(xi)胞(bao)消化(hua)(hua)。（加(jia)(jia)(jia)入1-2ML的(de)(de)(de)PBS， 我是會貼壁加(jia)(jia)(jia)入到培(pei)養皿(min)的(de)(de)(de)邊緣，不能(neng)直(zhi)接對著細(xi)(xi)胞(bao)加(jia)(jia)(jia)入PBS，容易把(ba)細(xi)(xi)胞(bao)都吹起來。這一(yi)步的(de)(de)(de)目(mu)的(de)(de)(de)是為了去(qu)掉(diao)殘(can)余的(de)(de)(de)培(pei)養基的(de)(de)(de)，殘(can)余的(de)(de)(de)培(pei)養基會含有(you)血清和(he)一(yi)些(xie)離(li)子等(deng)，不利于(yu)接下來的(de)(de)(de)消化(hua)(hua)。此外，常見的(de)(de)(de)是0.25%的(de)(de)(de)胰酶(mei)(mei)。一(yi)般(ban)根據細(xi)(xi)胞(bao)皿(min)的(de)(de)(de)大小加(jia)(jia)(jia)入胰酶(mei)(mei)，對于(yu)10cm的(de)(de)(de)dish，我會加(jia)(jia)(jia)入1ml的(de)(de)(de)胰酶(mei)(mei)。）
2：放到37攝(she)氏度培養箱(xiang)30s-1min（我(wo)這里處(chu)理的(de)(de)是(shi)293T細胞，不同的(de)(de)細胞的(de)(de)消化(hua)時(shi)間是(shi)不一(yi)樣的(de)(de)，需要具體的(de)(de)去(qu)查一(yi)查，如果消化(hua)的(de)(de)好的(de)(de)細胞是(shi)會呈現流(liu)沙狀態的(de)(de)，上(shang)下(xia)晃(huang)動(dong)(dong)都會隨(sui)著移動(dong)(dong)的(de)(de)。）
3：加入含(han)有血(xue)清的(de)培養(yang)液終(zhong)(zhong)止(zhi)消化(hua)(hua)，用(yong)槍把培養(yang)液吹勻(yun)。（因(yin)為含(han)有血(xue)清可以終(zhong)(zhong)止(zhi)胰酶的(de)消化(hua)(hua)反(fan)應，用(yong)槍吹培養(yang)皿(min)底是為了把殘留在底部(bu)的(de)細胞吹起來）
4：轉(zhuan)移到15ml的離心管中，離心，200g 5-10min(一般我是1000rpm離心3min)
5：去掉(diao)上(shang)(shang)清(qing)液(ye)，然(ran)后(hou)用PBS 重(zhong)懸細胞，加(jia)入的(de)PBS的(de)量(liang)是10ML。再次離(li)心(xin)，去掉(diao)上(shang)(shang)清(qing)。
6：加入適量的培養(yang)基，把細(xi)胞重懸，然后轉移到(dao)(dao)培養(yang)皿里面(mian)。放入到(dao)(dao)37攝氏度的5%的二氧化碳培養(yang)箱。
懸浮細胞傳代:
1：對(dui)于(yu)懸(xuan)浮細胞，達到(dao)匯合狀態時，懸(xuan)浮培(pei)養的細胞會(hui)(hui)聚集(ji)成團(tuan)塊，轉動培(pei)養瓶時培(pei)養基會(hui)(hui)變得渾濁。（GM12878非常典型，當然了，有的細胞不會(hui)(hui)聚集(ji)成團(tuan)，比如(ru)說K562）
2：可(ke)以(yi)用臺盼藍溶液+自動(dong)細(xi)胞計數器或血細(xi)胞計數器，確定細(xi)胞的密度，計算需要添加的培(pei)養(yang)基體(ti)積，將培(pei)養(yang)物(wu)稀(xi)釋至建(jian)議的接種(zhong)密度。
3：一般(ban)是(shi)按比例稀釋一下(xia)培(pei)養基，然后繼續傳(chuan)代。（我在(zai)傳(chuan)K562的(de)時候，是(shi)會(hui)1：4的(de)比例去傳(chuan)代，保證(zheng)細(xi)胞密度在(zai)1M/ML以下(xia)，能達(da)到對(dui)數生(sheng)長(chang)期，細(xi)胞處于旺盛的(de)分裂期）
4：把細(xi)胞(bao)放入(ru)到(dao)37℃，5%的(de)二氧(yang)化碳(tan)培養(yang)(yang)箱中，進行(xing)培養(yang)(yang)

傳代問題解決方案:
1.傳代密度過高
一旦細(xi)胞(bao)養太久至融合(he)度過高（>90%）才傳代(dai)，容易使(shi)細(xi)胞(bao)產生(sheng)老(lao)化(hua)現(xian)象(xiang)，甚至是堆(dui)疊，再消化(hua)細(xi)胞(bao)時不易吹打(da)成單顆細(xi)胞(bao)，即便再重(zhong)新鋪(pu)盤傳代(dai)，細(xi)胞(bao)也無法回(hui)到原(yuan)本的特性了。（如：單層細(xi)胞(bao)，沒(mei)長(chang)滿就發(fa)生(sheng)堆(dui)疊現(xian)象(xiang)）
解決方案:
盡量(liang)避免(mian)融(rong)合(he)度(du)(du)過高(gao)，鏡下觀察融(rong)合(he)度(du)(du)約達到80%即可傳代分盤。
細(xi)(xi)胞(bao)融合度：在細(xi)(xi)胞(bao)培(pei)養中指的(de)是細(xi)(xi)胞(bao)在培(pei)養表面（培(pei)養皿(min)/瓶）所占(zhan)的(de)比例。

2.傳代密度過低
哺乳動物貼壁培養細(xi)胞，若細(xi)胞培養到(dao)80-90%密度(du)需要開始傳(chuan)(chuan)代，在傳(chuan)(chuan)代接(jie)種細(xi)胞密度(du)過低，細(xi)胞間距離太(tai)遠(yuan)，就(jiu)無(wu)法在細(xi)胞間產(chan)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)黏附及通信作用(yong)，幫助信號傳(chuan)(chuan)導并活化細(xi)胞；總體細(xi)胞量(liang)不(bu)足(zu)(zu)，分泌(mi)的(de)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)長因(yin)子濃(nong)度(du)會不(bu)足(zu)(zu)以(yi)產(chan)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)利于生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)長的(de)微環境，以(yi)上皆(jie)會造成增(zeng)殖速度(du)遲緩或細(xi)胞死亡。
解決方案:
細(xi)胞(bao)傳代時，要進(jin)行準確的細(xi)胞(bao)計數(shu)，確保鋪盤的密度.