PCR反應體系包括什么組份

 PCR反(fan)應(ying)體系由反應緩沖液（PCR Buffer）、脫氧核苷三磷酸底物（dNTP mix）、耐熱DNA聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分組成。各個組份對PCR結果至關重要。

1. 反應緩沖液(ye)：一般隨Taq DNA聚合酶試劑盒供應。

標準緩沖液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3，室溫），1.5mM MgCl2。Mg2+的濃度對反應的特異性及產量有著顯著影響；濃度過高，使反應特異性降低；濃度過低，使產物減少。在各種單核苷酸濃度為200 μM時，Mg2+為1.5 mM較合適。若樣品中含EDTA或其它螯合物，可適當增加Mg2+的濃度，在高濃度DNA及dNTP條件下進行反應時，也必須相應調節Mg2+的濃度。據經驗，一般以1.5-2mM（終濃度）較好（僅供參考）。

2. dNTP ：高濃度dNTP易產生錯誤摻入，過高則可能不擴增；但濃度過低，將降低反應產物的產量。PCR中常用終濃度為50-400 μM的dNTP。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度應相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于 其它幾種時（偏高或偏低），就會誘發聚合酶的錯誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應。此外，dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。因此，dNTP的濃度直接影響到反應中起重要作用的Mg2+濃度。

3. Taq DNA聚合(he)酶：在100μL反應體系中，一般加入2-4U的酶量，足以達到每min延伸1000-4000個核苷酸的摻入速度。酶量過多將導致產生非特異性產物。但是，不同的公司或不同批次的產品常有很大的差異，由于酶的濃度對 PCR 反應影響極大，因此應當作預試驗或使用廠家推薦的濃度。當降低反應體積時（如20μL或 50 μL），一般酶的用量仍不小于2U，否則反應效率將降低。

4. 引(yin)物：引物是擴增PCR結果的關鍵，引物設計在PCR反應中極為重要。要保證PCR反應能準確、特異、有效地對模板DNA進行擴增，通常引物設計要遵循以下幾條原則：

（1）引物的長度以15-30 bp為宜，通常設計長度為17-25bp；GC含量在40-60%（最好在45-55%）；兩條引物的Tm值應盡量接近，可以采用專用軟件來計算（Primer Premier 5）；盡量避免A/G或T/C的連續排列，局部避免GC rich或AT rich（特別是3’端），堿基的分布應表現出是隨機的。

（2）互(hu)補性(xing)，引物內部或兩條引物之間避免3個堿基以上的互補序列，引物末端避免2base以上的互補序列。引物的3’端不應與引物內部有互補，避免引物內部形成二級結構，兩個引物在3’端不應出現同源性，以免形成引物二聚體。3’端末位堿基（最好是G或C，避免為T）在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。

（3）引物濃度(du)不(bu)宜偏高，濃度(du)過高有兩個(ge)弊端：一是容易形成引物二聚體（primer-dimer），二是當擴增微量靶序列并且起始材料又比較粗時，容易產生非特異性產物。一般說來，用低濃度引物不僅經濟，而且反應特異性也較好。一般用0.25-0.5pM/μL較好。

（4）引物一般用TE配制成較高濃度的母液（約100 μM），保存于-20 ℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10 μM或20 μM的工作液。

5．模(mo)板：PCR對模(mo)板(ban)的(de)要(yao)求不高，單(dan)、雙鏈DNA均可作為(wei)(wei)PCR模(mo)板(ban)。雖然 PCR 可以微(wei)量(liang)的(de)樣品（甚至是來自單(dan)一細胞的(de)DNA）作為(wei)(wei)模(mo)板(ban)，但為(wei)(wei)了保證(zheng)反應的(de)特異性，一般還宜用μg水平的(de)基因組(zu)DNA或(huo) 拷貝數較(jiao)高的(de)待擴增片(pian)段作為(wei)(wei)起(qi)始模(mo)板(ban)。原材(cai)料可以是粗制(zhi)(zhi)品，某些材(cai)料甚至僅需用溶(rong)劑一步提(ti)取之后(hou)即可用于(yu)擴增，但混有(you)任(ren)何(he)蛋白(bai)酶(mei)、核酸(suan)酶(mei)、Taq DNA 聚(ju)合酶(mei)抑制(zhi)(zhi)劑以及能(neng)結合 DNA 的(de)蛋白(bai)，將可能(neng)干擾PCR反應。

6. PCR循環加快，即相(xiang)對減少變性(xing)、復性(xing)、延伸的時間，可增加產物的特異性(xing)。

四、注意事項：

1.PCR應(ying)該在沒有DNA污染的(de)干凈(jing)環境(jing)中進行，最好設立一個專用的(de)PCR配制室、模板室、擴增室，避免污染（16S）。

2.純(chun)化(hua)模板所選(xuan)用的方(fang)法對污染的風(feng)險有極大影響(xiang)。一般而(er)言，只(zhi)要能(neng)夠(gou)得到(dao)可靠的結果，純(chun)化(hua)的方(fang)法越(yue)簡單越(yue)好。

3.所有試劑都應該沒有核酸(suan)和核酸(suan)酶的污染，操作過程中均應戴(dai)手套(tao)。

4.PCR試劑配制應使用最高(gao)(gao)質(zhi)量(liang)的(de)新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜(mo)過濾除菌(jun)或高(gao)(gao)溫高(gao)(gao)壓滅(mie)菌(jun)。

5.試劑都(dou)應該以大體積配制，然后分裝成僅(jin)夠一次使用的量儲存，從而確保實驗(yan)(yan)與實驗(yan)(yan)之間的連續性與平行性。

6.試(shi)劑或樣品準備過程中都要使用滅菌(jun)的tubes和(he)tips，玻璃器皿應洗滌干(gan)凈并高壓滅菌(jun)。

7.PCR配制試劑(ji)應(ying)在(zai)冰(bing)上融(rong)化，并(bing)且要瞬離并(bing)充分混勻。