PCR反應體系包括什么組份

 PCR反(fan)應體系由(you)反應(ying)緩沖液（PCR Buffer）、脫氧核苷三磷酸底物（dNTP mix）、耐熱DNA聚合酶（Taq 酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分組成。各個組份對PCR結果至關重要。

1. 反(fan)應緩沖液：一般隨Taq DNA聚合酶試劑盒供應。

標準緩沖液含：50mM KCl，10mM Tris-HCl（pH8.3，室溫），1.5mM MgCl2。Mg2+的濃度對反應的特異性及產量有著顯著影響；濃度過高，使反應特異性降低；濃度過低，使產物減少。在各種單核苷酸濃度為200 μM時，Mg2+為1.5 mM較合適。若樣品中含EDTA或其它螯合物，可適當增加Mg2+的濃度，在高濃度DNA及dNTP條件下進行反應時，也必須相應調節Mg2+的濃度。據經驗，一般以1.5-2mM（終濃度）較好（僅供參考）。

2. dNTP ：高濃度dNTP易產生錯誤摻入，過高則可能不擴增；但濃度過低，將降低反應產物的產量。PCR中常用終濃度為50-400 μM的dNTP。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度應相同，如果其中任何一種的濃度明顯不同于 其它幾種時（偏高或偏低），就會誘發聚合酶的錯誤摻入作用，降低合成速度，過早終止延伸反應。此外，dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。因此，dNTP的濃度直接影響到反應中起重要作用的Mg2+濃度。

3. Taq DNA聚(ju)合(he)酶：在100μL反應體系中，一般加入2-4U的酶量，足以達到每min延伸1000-4000個核苷酸的摻入速度。酶量過多將導致產生非特異性產物。但是，不同的公司或不同批次的產品常有很大的差異，由于酶的濃度對 PCR 反應影響極大，因此應當作預試驗或使用廠家推薦的濃度。當降低反應體積時（如20μL或 50 μL），一般酶的用量仍不小于2U，否則反應效率將降低。

4. 引物：引物是擴增PCR結果的關鍵，引物設計在PCR反應中極為重要。要保證PCR反應能準確、特異、有效地對模板DNA進行擴增，通常引物設計要遵循以下幾條原則：

（1）引物的長度以15-30 bp為宜，通常設計長度為17-25bp；GC含量在40-60%（最好在45-55%）；兩條引物的Tm值應盡量接近，可以采用專用軟件來計算（Primer Premier 5）；盡量避免A/G或T/C的連續排列，局部避免GC rich或AT rich（特別是3’端），堿基的分布應表現出是隨機的。

（2）互補性，引物內部或兩條引物之間避免3個堿基以上的互補序列，引物末端避免2base以上的互補序列。引物的3’端不應與引物內部有互補，避免引物內部形成二級結構，兩個引物在3’端不應出現同源性，以免形成引物二聚體。3’端末位堿基（最好是G或C，避免為T）在很大程度上影響著Taq酶的延伸效率。

（3）引物濃(nong)度(du)(du)不宜偏高，濃(nong)度(du)(du)過(guo)高有兩個弊端：一是容易形成引物二聚體（primer-dimer），二是當擴增微量靶序列并且起始材料又比較粗時，容易產生非特異性產物。一般說來，用低濃度引物不僅經濟，而且反應特異性也較好。一般用0.25-0.5pM/μL較好。

（4）引物一般用TE配制成較高濃度的母液（約100 μM），保存于-20 ℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10 μM或20 μM的工作液。

5．模板：PCR對模(mo)板的(de)要(yao)求不(bu)高(gao)，單、雙鏈DNA均可(ke)作(zuo)為(wei)(wei)PCR模(mo)板。雖然 PCR 可(ke)以微量(liang)的(de)樣品(pin)（甚至是來自(zi)單一細胞(bao)的(de)DNA）作(zuo)為(wei)(wei)模(mo)板，但為(wei)(wei)了(le)保證反應(ying)的(de)特(te)異性，一般還宜用μg水平的(de)基(ji)因組(zu)DNA或(huo) 拷貝(bei)數較高(gao)的(de)待擴(kuo)增片段作(zuo)為(wei)(wei)起始(shi)模(mo)板。原材料(liao)可(ke)以是粗(cu)制品(pin)，某些材料(liao)甚至僅需用溶劑一步提(ti)取之后即可(ke)用于擴(kuo)增，但混(hun)有任何蛋白酶、核(he)酸(suan)酶、Taq DNA 聚合(he)酶抑制劑以及能(neng)結(jie)合(he) DNA 的(de)蛋白，將(jiang)可(ke)能(neng)干擾PCR反應(ying)。

6. PCR循環加快(kuai)，即(ji)相對減少變性(xing)、復(fu)性(xing)、延伸的時間，可增(zeng)加產物的特異性(xing)。

四、注意事項：

1.PCR應該(gai)在(zai)沒有DNA污(wu)染的干凈環境中進行，最好(hao)設立一(yi)個專用的PCR配制室、模板室、擴(kuo)增室，避免污(wu)染（16S）。

2.純(chun)化模板所選用的(de)方(fang)法(fa)對污染的(de)風險有極大(da)影響。一般而言(yan)，只要能(neng)夠得(de)到可靠的(de)結果，純(chun)化的(de)方(fang)法(fa)越簡單越好(hao)。

3.所有試劑都(dou)應該沒有核酸和(he)核酸酶的污染，操作過程中均應戴手(shou)套。

4.PCR試劑(ji)配制應(ying)使用最高質量(liang)的新鮮雙(shuang)蒸水，采(cai)用0.22μm濾(lv)(lv)膜過濾(lv)(lv)除(chu)菌或高溫高壓(ya)滅(mie)菌。

5.試劑(ji)都(dou)應該(gai)以大體積配(pei)制，然后分裝成僅夠一次(ci)使用的量儲存，從(cong)而確(que)保實驗與(yu)實驗之間的連續性(xing)與(yu)平行性(xing)。

6.試劑(ji)或(huo)樣品準備過程中都要使用滅菌的tubes和tips，玻璃器皿應洗(xi)滌干凈并高(gao)壓滅菌。

7.PCR配制試劑應在冰上(shang)融(rong)化，并且要瞬離并充分混勻。