影響ELISA試驗結果要素分析

酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是(shi)一種(zhong)特殊(shu)的(de)試劑分析方(fang)法(fa)，在(zai)免疫酶技術的(de)基礎上發展起(qi)來的(de)一種(zhong)新(xin)型的(de)免疫測定技術，其試劑易于保存、結果判斷(duan)較為(wei)客觀，是目前(qian)實驗室檢測(ce)抗原抗體最(zui)經濟、最普(pu)遍的試驗診斷方法(fa)。

影響ELISA試驗結果要(yao)素分(fen)析(xi)如(ru)下(xia)：

1 、試劑的(de)準(zhun)備(bei)

試劑的質量如抗原抗體的純度及親和力、標記物的比活性、滴度及特異性等直接影響檢測結果，為保證檢測質量，所有試劑必需經國家食品藥品監督管理總局注冊批準、批檢測合格，臨床評估特異性、敏感性、穩定性較高且在有效期內才有使用價值。不同試劑敏感性、特異性不盡相同，有報道不同酶標板孔間 A 值差大小可達 15%，標記酶的活性及顯色液的穩定性也相差較大，所以合理有效的試劑選擇尤為重要，對 ELISA 試劑盒應正確選擇，定期評價并建立科學的接收標準，結合常規血液篩查情況，對實際的均一性、適用性、穩定性，選出靈敏度、特異度及精密性合適的試劑保證檢測結果的準確。有報道不同-IgG 配制成的抗 HCV-cAg 酶結合物溶液對檢測結果有區別，配制抗 HCV-cAg 酶結合物溶液前應檢測小鼠-IgG 與產品的適配性。其次試劑盒的儲存方式、運輸條件及有效期均為影響檢測結果的重要因素，試劑盒一般 2~8℃冰箱保存，注意不要緊貼冰箱儲存室后壁以防止試劑凍結失效，可避免使用時試劑受溫差影響導致酶標板上凝集小水珠及反應出現溫差而影響抗原抗體的反應。使用前需將試劑盒放置 37℃恒溫箱溫育30min，且不同、不同批號的試劑不能混合使用。剩余試劑應及時放入干燥劑密封保存在 2~8℃冰箱，試劑打開后一周內有效，同時注意做好室內質檢，確保實驗結果的可靠性。

不同方法學的檢驗試劑會使乙肝兩對半結果出現不同，如臨床操作中電化學檢測 HBsAg 呈陽性，而采用 ELISA 檢測則呈陰性，此外，使用單抗或多抗試劑對檢測結果同樣造成一定的影響。研究表明 ELISA 檢測細胞因子時需要根據檢測的細胞因子選擇不同的裂解液進行處理，避免裂解液對細胞因子產生影響導致假陰性結果。

2、 樣(yang)本的采集、保存及預處理(li)

標本的運輸及保存、檢測人員的自身素質均可能對檢測結果造成不良影響，為避免出現錯誤樣品應準確標明編號、種類、受檢者姓名及采集時間，收集后認真核對，拒收不符合要求的標本及申請單，嚴格按照拒收制度處理，同時處理合格標本，做好后續工作，避免延誤導致標本出現溶血等其它不良情況。標本的預處理對檢測結果有非常明顯的影響，臨床工作中有時為了快速得出檢測結果在血液開始凝固前強行離心分離血清，血清中殘留的纖維蛋白絲對實驗結果造成影響，標本離心需*且必須待血液凝固后方能分離血清，也可在標本采集時使用帶分離膠的采血管提取，使用未混入保存液的血液做檢測標本。在此過程中保證待檢標本新鮮、避免細菌污染，否則易出現假陽性結果，若不能及時檢測可將分離的血清于 4℃保存，超過一周于-20℃保存，避免反復凍融，防止出現假陰性結果。若血清中含有類風濕因子或免疫復合物也將造成假陽性結果。

3、加(jia)樣 ELISA 檢測

加(jia)(jia)(jia)樣時(shi)應垂直將樣本準確(que)加(jia)(jia)(jia)入(ru)(ru)微孔底部，注意避(bi)免(mian)(mian)吸(xi)頭(tou)(tou)碰(peng)到酶標(biao)(biao)板上的(de)(de)包被物，盡量(liang)(liang)慢吸(xi)快放，防(fang)止(zhi)濺(jian)出或(huo)產生氣泡，避(bi)免(mian)(mian)液(ye)(ye)體(ti)外濺(jian)使(shi)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)殘留(liu)在(zai)反應壁(bi)上。每(mei)(mei)次吸(xi)樣注意更換(huan)吸(xi)頭(tou)(tou)，做到一樣一吸(xi)頭(tou)(tou)，避(bi)免(mian)(mian)交叉污染，干吸(xi)頭(tou)(tou)每(mei)(mei)次加(jia)(jia)(jia)樣前(qian)在(zai)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)中抽吸(xi)三次保證吸(xi)樣準確(que)，滴加(jia)(jia)(jia)試劑(ji)時(shi)建(jian)議先(xian)將滴瓶(ping)搖(yao)勻擠去第一滴再加(jia)(jia)(jia)樣。加(jia)(jia)(jia)樣前(qian)先(xian)將微孔板平放在(zai)板架臺上，以免(mian)(mian)對洗(xi)板機(ji)的(de)(de)自動操作帶來影響，為了保證加(jia)(jia)(jia)樣的(de)(de)準確(que)性(xing)，建(jian)議使(shi)用準確(que)性(xing)高的(de)(de)微量(liang)(liang)移液(ye)(ye)器(qi)且定期進(jin)行校正。加(jia)(jia)(jia)樣品稀釋(shi)液(ye)(ye)、酶結合(he)物應用液(ye)(ye)、底物應用液(ye)(ye)及終止(zhi)液(ye)(ye)時(shi)可(ke)采(cai)用定量(liang)(liang)多道加(jia)(jia)(jia)液(ye)(ye)器(qi)，迅速完成加(jia)(jia)(jia)液(ye)(ye)過程(cheng)，加(jia)(jia)(jia)樣后用不(bu)(bu)干膠或(huo)膠帶紙封(feng)好酶標(biao)(biao)板防(fang)止(zhi)水分(fen)蒸發或(huo)雜物進(jin)入(ru)(ru)孔內，注意封(feng)板膜不(bu)(bu)可(ke)二次利用，避(bi)免(mian)(mian)交叉污染，剩余的(de)(de)微孔板、不(bu)(bu)干膠或(huo)膠帶紙與干燥劑(ji)一同(tong)保存在(zai)備用自封(feng)塑料袋中。大批(pi)量(liang)(liang)檢測大型機(ji)構(gou)體(ti)檢標(biao)(biao)本時(shi)可(ke)采(cai)用直接加(jia)(jia)(jia)入(ru)(ru)適量(liang)(liang)血(xue)(xue)清(qing)(qing)(qing)的(de)(de)加(jia)(jia)(jia)樣模(mo)式，經(jing)濟(ji)環保提(ti)高工作效率。

在實際操作過程中，待檢標本和酶標志物先后順序加入，于是在競爭法中因為兩者的不同時加入而存在一個“不公平”競爭現象，研究表明，競爭法 ELISA 檢測受加樣方法的影響存在統計學意義，將標本和酶標志物先在試管中等量混和均勻后再加入酶標板小孔杯中可降低抗-HBc 檢測的假陽性率。

4、 溫(wen)育

溫育是 ELISA 至關重要的一步，不同的溫育環境對檢測結果有影響，操作中應嚴格按照說明書控制溫育時間及溫度，并注意封閉避免邊緣效應。為確保各板溫度都能迅速達到平衡，不可將反應板疊加放置，設定的溫度及時間嚴格按照說明書進行，一般加入待測標本后使其與固相抗原(抗體)置于 37℃環境下溫育。因為很多恒溫箱的構造，溫度及檢測的溫度并非酶標板溫育溫度，所以使用恒溫箱溫育時建議將溫度計置于酶標板旁，保證酶標板旁溫度為 37℃。干育和水溫的影響差異較為明顯，建議使用水溫，注意將固相板放入水中，防止受熱不均勻。

溫育時間是影響檢測結果的一大因素，實際操作過程中工作人員常常試圖縮短溫育時間提高工作效率，曹青梅等通過實驗證明，對于低濃度的標本，待測標本與固相抗體反應時間過短，極易引起漏檢，反應時間最少 30min 以上。羅保紅等報道，酶標反應預孵時間在溫室中不超過 15min，不但能保障 ELISA 檢測抗-HIV、抗-HCV 的實驗結果，還能提高試劑檢測的靈敏度。其傳統溫育采用水溫箱易受污染，現多采用電熱、電子恒溫培養箱溫育，研究表明溫育方式對 ELISA 檢測物影響。陳懷霞報道，ELISA 檢測中，溫度對抗原、抗體及酶反應的影響很大，溫度增高，分子運動加速，并可能出現非特異性反應，出現假陰性或者假陽性結果，檢測控制恒溫 37℃可保證檢測的準確性。

5、 洗板

洗板目的在于將特異性結合于固相上的抗原(抗體)與溫育過程中吸附的非特異性成份分離，使免疫復合物與待測抗體(抗原)呈一定比例，洗板是否合格直接影響檢測結果的準確性。洗板應嚴格按照說明控制洗板時間及洗板次數， ELISA 檢測一般用洗滌液洗板 3 次，洗滌液應嚴格按照操作說明進行稀釋，洗液應注滿每個微孔并注意洗液不外溢，垂直甩板避免交叉污染，防止出現假陰性及假陽性結果。使用洗板機洗板可一定程度上避免環境污染、提高工作效率，洗滌開始時注意觀察每根吸液針是否一直插入孔底并吸干孔內全部液體，嚴格按照要求設置一定的洗板時間及洗板次數。洗板過程中注意沖力大小，避免沖力過大導致酶結合物丟失，吸光度值偏低。洗液應根據不同的酶標板調整注水量，注意不要溢出孔外；稀釋洗液所用的蒸餾水或去離子水酸堿度適中，使配出的洗液 pH 在 7.2~7.6 范圍內，用非金屬容器保存，保持液體新鮮無污染、沉淀。洗板結束后將板拍干，應垂直扣在備好的干凈的吸水紙或毛巾上，且注意每次更新干凈的吸水紙或毛巾。

洗板時(shi)還應(ying)注意(yi)事(shi)項：

(1) 需每天校正注液量及殘液量，洗滌后殘液量不得大于 2μl；

(2) 及時(shi)更換(huan)破損吸(xi)液針，避免破壞底板包被；

(3) 針對不同(tong)酶標(biao)板注意(yi)調整吸液(ye)頭下降高度，避免沖洗針頭卡住酶標(biao)板；

(4) 注意調整洗液(ye)量，洗液(ye)量過多將溢出，過少(shao)將達不到洗滌效(xiao)果(guo)；

(5) 關(guan)機前(qian)使(shi)用蒸餾水沖洗(xi)管道，避免洗(xi)液(ye)的結晶(jing)物堵(du)塞管道；

(6) 不同種試劑盒的洗液嚴禁(jin)混合使用。臨床操作(zuo)中(zhong)，工(gong)作(zuo)人員由于擔心洗板次(ci)(ci)數(shu)(shu)過少達(da)不到去除(chu)非特(te)異性物(wu)質的理想(xiang)效果(guo)而增加洗板次(ci)(ci)數(shu)(shu)，最近(jin)研究(jiu)發現，隨著(zhu)洗板次(ci)(ci)數(shu)(shu)的增加樣本檢測的 OD 值降低，造成假陰性結果(guo)及灰區標本的漏檢。

6、 顯色(se)及結果判斷

試劑顯色時 A、B 液按順序加入且間隔不超過 10min，如先將兩液混合再加樣則需保證等體積混合。顯色劑不宜過多，注意避光反應。顯色是最后一步溫育反應，酶將無色底物催化反應呈有色，反應的溫度和時間均為影響結果的重要因素，目前市場上大多數進口的 ELISA 檢測顯色溫度處于 18~30℃。一定時間內，陰性孔可保持無色，但陽性孔會隨時間的延長而顯色加強。研究表明，顯色溫度對實驗結果有明顯影響，顯色溫度不同，試劑*低檢測能力差距非常大，溫度低于 21℃時試劑盒對于質控物的檢出能力下降，溫度過低導致結合反應速率變慢，顯色不充分，造成低值陽性結果的漏檢，所以操作中應嚴格控制溫度。顯色時間不宜過短，因為一些低滴度可能不能及時出現反應，造成假陰性結果。結果判斷應按照說明書在規定時間內完成，研究報道終止反應后的時間對 OD 值結果有明顯影響，10~15min陽性結果 OD 值逐漸下降，陰性結果的 OD 值有所上升，所以必須嚴格按照操作說明進行，薛春楊等認為結果判斷需在加入終止液后 10min 內完成，避免出現孔內結晶影響酶標儀的測試，避免強光下進行。

在(zai)加液(ye)和混合過程中(zhong)產生氣泡、微(wei)孔條底部不(bu)透明(ming)、帶水滴、有劃(hua)痕及不(bu)規則(ze)的(de)表(biao)面都可能(neng)引(yin)起吸(xi)光值(zhi)的(de)升高，易(yi)造成假陽性結果(guo)，若顯色但(dan)酶標儀讀值(zhi)為陰性的(de)灰(hui)色值(zhi)樣區的(de)樣本不(bu)管其是否來源于高危人(ren)群均(jun)需復(fu)檢并參考參比(bi)試(shi)劑(ji)。

7、 其(qi)它因素

實驗室的環境亦是影響試驗結果的一大因素，合理控制實驗室的通風、采光及防塵，實驗室的溫度及濕度可使用空調加以控制，濕度控制在 35%~65%間，并避免噪音及電磁波干擾。

檢(jian)測結果對(dui)受檢(jian)者的(de)(de)家庭(ting)、生活及(ji)工(gong)作(zuo)(zuo)非常重要(yao)，可能(neng)帶來嚴重的(de)(de)精神(shen)痛苦及(ji)巨(ju)大的(de)(de)心(xin)理壓力，因(yin)此檢(jian)驗(yan)(yan)工(gong)作(zuo)(zuo)者應不斷提高自身素質，加(jia)強使命感(gan)與責(ze)任心(xin)，盡(jin)(jin)職盡(jin)(jin)責(ze)認真對(dui)待(dai)每一份待(dai)檢(jian)標(biao)本，嚴格按照實(shi)驗(yan)(yan)室(shi)的(de)(de)標(biao)準(zhun)化操(cao)作(zuo)(zuo)，試(shi)(shi)劑(ji)的(de)(de)選擇(ze)和準(zhun)備(bei)、樣(yang)品的(de)(de)采集(ji)和儲存(cun)、操(cao)作(zuo)(zuo)等方面(mian)，嚴格按照說明書(shu)要(yao)求，規范化操(cao)作(zuo)(zuo)，同時做好實(shi)驗(yan)(yan)室(shi)內(nei)質控(kong)、室(shi)間(jian)質評，排(pai)除影響(xiang)因(yin)素，嚴格控(kong)制試(shi)(shi)驗(yan)(yan)環(huan)境(jing)，牢牢把(ba)關試(shi)(shi)劑(ji)選擇(ze)、試(shi)(shi)驗(yan)(yan)溫度、儀器設備(bei)等每一環(huan)節，最大限(xian)度地降(jiang)低檢(jian)測的(de)(de)系統(tong)誤差，加(jia)強自身理論知識的(de)(de)學習，在工(gong)作(zuo)(zuo)中總結經驗(yan)(yan)、揚長避(bi)短，減(jian)少(shao)人為(wei)因(yin)素對(dui)試(shi)(shi)驗(yan)(yan)結果造成影響(xiang)，提高檢(jian)測的(de)(de)準(zhun)確性，減(jian)少(shao)假陰性、假陽(yang)性結果的(de)(de)出現。

ELISA 檢測廣泛應(ying)用(yong)于乙肝(gan)、丙(bing)肝(gan)、梅毒(du)、艾(ai)滋以及(ji)結核(he)等傳染類疾病(bing)的診斷(duan)，對于含(han)有疑似干擾物的待檢樣本(ben)做相(xiang)應(ying)分析，在保證結果可靠的前(qian)提(ti)下(xia)盡量(liang)避免(mian)二次抽(chou)血。為保證檢驗工作者的自身安全，操(cao)作時(shi)必須帶好口罩、手(shou)套，穿(chuan)好工作衣(yi)，嚴格進行規范(fan)操(cao)作，防止交叉(cha)感(gan)染。有條件的情(qing)況下(xia)可使用(yong)酶(mei)聯免(mian)疫反應(ying)加速儀縮短反應(ying)時(shi)間，提(ti)高工作效率。