實時熒光定量PCR引物和探針儲存依據

  目前所有的探針法qPCR的理論基礎都是利用了熒光共振能量轉移現象，探針上存在一對能產生熒光共振能量轉移的基團，利用PCR反應中的一些過程（酶切，雜交等），使兩個基團的距離產生變化，使系統中的熒光強度或者熒光種類發生變化，這種變化又與PCR產物的種類和量有直接關系，通過檢測這種變化，我們就可以檢測出PCR反應體系中產物的種類和量。探針法來說，反應管中的熒光強度也是檢測PCR產物量的依據。

1、引物和(he)探針的(de)儲存(cun)

盡管引物和探針的儲存經常被忽略，但其在保證實時熒光定量 PCR 分析的長期成功和一致性方面具有重要作用。影響引物和探針的穩定性的主要因素是儲存溫度、儲存時間、是否被長時間暴光、的引物和探針的濃度以及儲存溶液的組分。圖3擴增曲線分別顯示了儲存不當的引物 (A) 與儲存適當的引物 (B) 產生的效果。

2、長期保持引物和探針的穩定性的關鍵(jian)有四(si)點：

（1）、低壓凍干的引物在儲存時間和溫度方面具有更好的靈活性。引物一旦重新溶解，即應置于 -20°C 保存，且若保存時間超過一年則應對其進行監測，看它是否出現功能下降。

（2）、對于標記的引物和探針，則應采取措施避免標記物暴光 (例如使用不透明管及置于暗處保存)，以延長它們的使用壽命。

（3）、引物濃度也可影響其穩定性。建議引物的儲存濃度不低于10 μM；實際上，在大多數情況下，100 μM 的引物濃度操作更簡單。引物和探針還應分裝保存，以減少凍融次數，特別是標記的引物和探針。

（4）、最后，TE 緩沖液可形成比水更為穩定的環境。此外，含有 0.1 mM EDTA的 TE 緩沖液 (標準 TE 中含有 1 mM EDTA) 是一種理想的溶液，這是由于一些 PCR 反應對 EDTA 的靈敏度可能有一些殘存。