解離原代組織細胞操作過程
原(yuan)代組(zu)織細胞(bao)(bao)的解離是從(cong)原(yuan)代組(zu)織上獲(huo)取單(dan)個(ge)細胞(bao)(bao)懸液的常用(yong)方法是利用(yong)酶(mei)的解聚作(zuo)用(yong)。盡量(liang)縮(suo)短用(yong)酶(mei)處理細胞(bao)(bao)的時間，以獲(huo)得(de)高的存活率(lv)。那么我(wo)們該如何解離原(yuan)代組(zu)織細胞(bao)(bao)呢？
胰酶：
1.先去(qu)除(chu)無關組(zu)織，然后用滅菌的解剖(pou)刀或剪刀將組(zu)織切成3-4mm大小碎(sui)塊。通過在不含鈣鎂的平衡鹽溶(rong)液(ye)進行重(zhong)懸(xuan)來清洗(xi)組(zu)織碎(sui)塊。待組(zu)織碎(sui)塊沉(chen)降(jiang)后去(qu)掉上(shang)清液(ye)。重(zhong)復(fu)清洗(xi)2-3次。
2.將裝有組織(zhi)碎塊的容器置于冰(bing)上，去(qu)掉所有上清液。在不含(han)鈣鎂的平衡鹽(yan)溶液中加(jia)入0.25%胰酶(mei)(每100mg組織(zhi)大約需要1ml 胰酶(mei))。
3.在4℃ 下孵育(yu)6-18小時，使(shi)低活性的胰(yi)酶盡量滲入(ru)組織。
4.緩慢倒掉胰(yi)酶(mei)。在37℃ 下(xia)將殘(can)余的胰(yi)酶(mei)與組織碎塊共同孵育(yu)20-30分鐘(zhong)。
5.向組織(zhi)(zhi)碎塊加入溫熱的完全培(pei)養基，并(bing)輕輕地(di)吹吸(xi)以分(fen)散(san)組織(zhi)(zhi)。如果使用無(wu)血清(qing)培(pei)養基。還應(ying)加入大豆胰酶抑制(zhi)劑(ji)。
6. 用滅菌的不銹鋼網(100-200μm)過濾細胞(bao)懸浮液，直(zhi)至所有組織完全散開。計算(suan)細胞(bao)個數(shu)，然后接種細胞(bao)進行培養。
膠原酶：
1.用滅菌的解(jie)剖刀(dao)(dao)或剪刀(dao)(dao)將組(zu)織(zhi)切成3-4mm大小碎(sui)(sui)塊(kuai)。用Hanks平衡鹽溶液(HBSS)將組(zu)織(zhi)碎(sui)(sui)塊(kuai)清(qing)洗數次。
2.加入膠(jiao)原酶(50-200單位/ml膠(jiao)原酶HBSS)。
3.在37℃ 下孵(fu)育(yu)4-18小(xiao)時。加(jia)入3mM CaCl2 可以提高(gao)解離效率。
4.用滅菌(jun)的不銹鋼網或尼(ni)龍(long)網過濾(lv)細胞懸浮液，將(jiang)離散的細胞和組(zu)織(zhi)片(pian)段與(yu)大(da)塊(kuai)的組(zu)織(zhi)碎片(pian)分離。如需進一步解離，可向組(zu)織(zhi)片(pian)段中加入新鮮(xian)的膠原酶。
5.通過離心HBSS清洗細胞懸浮液數次。
6.用(yong)培(pei)養(yang)基重懸細(xi)胞(bao)(bao)。計算細(xi)胞(bao)(bao)個數，然(ran)后(hou)接種細(xi)胞(bao)(bao)進行(xing)培(pei)養(yang)。
分散酶：
1.用滅菌的(de)(de)解(jie)剖刀(dao)(dao)或(huo)剪刀(dao)(dao)將組織(zhi)切成3-4mm大小碎塊。用不含鈣(gai)鎂(mei)離子的(de)(de)平衡鹽溶液清洗組織(zhi)碎塊數次。
2.加入(ru)分(fen)散酶(mei)(0.6-2.4單位/ml分(fen)散酶(mei)不含鈣鎂的(de)平衡鹽(yan)溶液(ye))。
3.在37℃下(xia)孵育(yu)20分鐘至數(shu)小時。
4.用滅菌的(de)不銹鋼(gang)網(wang)(wang)或尼友網(wang)(wang)過濾細胞懸浮液，將(jiang)離(li)(li)散的(de)細胞和組(zu)(zu)織(zhi)片段(duan)與大塊的(de)組(zu)(zu)織(zhi)碎片分離(li)(li)。如(ru)需(xu)進一步解離(li)(li)，可向組(zu)(zu)織(zhi)片段(duan)中加入新鮮分散酶。
5.通(tong)過離心平衡鹽溶液清(qing)洗細胞懸浮(fu)液數次。
6.用培養基重懸(xuan)細(xi)胞(bao)。計(ji)算細(xi)胞(bao)個(ge)數，然后接種細(xi)胞(bao)進行培養。
按以(yi)上的方(fang)法解聚原代組(zu)織細胞，我(wo)們就(jiu)可以(yi)獲得大量細胞。
