蛋白試劑盒使用方法步驟

BCA蛋白試劑盒是進行蛋白質濃度測定的最常見的方法之一。BCA蛋白定量的主要原理是：蛋白質在堿性條件下，可以將二價Cu2+離子還原成一價Cu+離子。產生的一價Cu+離子可以與BCA（Bicinchoninicacid）試劑結合，最終生成紫色的復合物。該復合物在562nm處有很強的吸收峰。復合物的多少與蛋白質的濃度呈接近的線性關系。
　使用方法步驟：
1、BCA工作液的配制
（1）BCA工作液總體積的計算：
BCA工作液總體積=（標準品數量+待測樣品數量+1）×重復數×200μL。
舉例：如果標準品數量為8，待測樣品數量1，重復數為3，則BCA工作液總體積=（8+1+1）×3×200μL=6000μL
（2）BCA工作液的配制：按50體積的BCA試劑A中加入1體積的BCA試劑B（A:B=50:1），充分混勻。
舉例：將5000μL的BCA試劑A與100μL的BCA試劑B混合，得到5100μL的BCA工作液。

　2、BSA標準品的配制
將BSA標準品做系列稀釋，分別得到如下9個不同濃度的標準品：2000μg/mL，1500μg/mL，1000μg/mL，500μg/mL，250μg/mL，125μg/mL，62.5μg/mL，31.25μg/mL，0μg/mL。
注：嚴格的蛋白定量，BSA標準品的稀釋溶液應該與待測蛋白樣品的溶液相同。但是一般情況下，BSA標準品可以直接用0.9%的NaCl、PBS或者去離子水進行稀釋。
　
3、取BSA標準品和待測樣品各25μL到96孔板孔內，
注：正常情況下，樣品與BCA工作液的體積之比應為1:8。如果樣品體積有限，也可使用10μLBSA標準品和待測樣品進行檢測（即樣品與BCA工作液的體積之比為1:20），這時BCA定量試劑盒的檢測范圍較小為125-2000μg/mL。

　4、往每孔中加入200μL的BCA工作液，蓋上96孔板蓋子。

5、將96孔板放37℃，30分鐘。

6、用酶標儀測562nm處的光吸收值。
注：562nm為最強的光吸收波長。如果無法檢測562nm處的光吸收值，也可以在540～595nm波長范圍內檢測光吸收值。

7、根據BSA標準品(pin)的(de)光吸(xi)(xi)收(shou)(shou)值（扣除空白(bai)孔的(de)光吸(xi)(xi)收(shou)(shou)值即為(wei)最終的(de)讀數），繪(hui)制標準曲(qu)線。依據標準曲(qu)線計算待測樣品(pin)的(de)蛋白(bai)濃度(du)。