ELISA實驗常見問題對策

1、標曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色

溶解標準品(pin)以(yi)及倍(bei)比稀釋(shi)時，未渦旋(xuan)震蕩(dang)或不夠充(chong)(chong)分。標準品(pin)溶解、倍(bei)比稀釋(shi)時均需要渦旋(xuan)震蕩(dang)以(yi)保證充(chong)(chong)分混(hun)勻。單(dan)純依靠(kao)移(yi)液器反(fan)復吹(chui)打(da)，效率(lv)較低、效果也不一定最佳(jia)。

2、標曲和樣本均不顯色

在孵育階段靜置在桌面上，這樣非(fei)常不(bu)利于(yu)抗(kang)原(yuan)抗(kang)體之間的(de)(de)充(chong)分(fen)接(jie)(jie)觸，導(dao)致顯色(se)偏弱。推薦孵育階段，使(shi)用ELISA專用的(de)(de)微孔板(ban)振蕩器，調至合適的(de)(de)頻率，使(shi)抗(kang)原(yuan)抗(kang)體充(chong)分(fen)接(jie)(jie)觸，保證結合效果。如果排除上述原(yuan)因(yin)，有可能(neng)是漏(lou)加了某個組分(fen)，如檢(jian)測(ce)抗(kang)體、酶等。對于(yu)比較馬虎的(de)(de)新手，一定要做好標記和記錄，或者使(shi)用添加染料的(de)(de)ELISA試劑盒(he)。

3、標曲顯色

樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)不(bu)顯色當樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)中目的(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)濃度(du)(du)極低或者樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)中干擾(rao)因素較(jiao)強，就無法(fa)檢(jian)測(ce)到(dao)。目前ELISA仍然是蛋(dan)白(bai)檢(jian)測(ce)靈敏(min)(min)(min)度(du)(du)最高的(de)(de)(de)方法(fa)，與不(bu)同技術結合后，衍(yan)生出了(le)多種類型的(de)(de)(de)ELISA，提(ti)高了(le)檢(jian)測(ce)靈敏(min)(min)(min)度(du)(du)。對(dui)于目的(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)濃度(du)(du)特別低的(de)(de)(de)樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)，可(ke)以嘗(chang)試(shi)用高敏(min)(min)(min)ELISA，但這(zhe)也(ye)并(bing)不(bu)意味著一定能(neng)檢(jian)測(ce)到(dao)樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)濃度(du)(du)，只能(neng)說可(ke)以提(ti)高樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)的(de)(de)(de)可(ke)測(ce)率，并(bing)使(shi)結果更加可(ke)靠。因為(wei)通常用普通ELISA檢(jian)測(ce)的(de)(de)(de)樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)OD值都偏(pian)低，而高敏(min)(min)(min)ELISA可(ke)提(ti)高樣(yang)(yang)(yang)本(ben)(ben)OD值，使(shi)之盡量位于標曲范圍(wei)內，得到(dao)的(de)(de)(de)數值也(ye)更加可(ke)信。

4、標曲和樣本都顯色

但復孔(kong)的(de)(de)CV大(da)(da)這個(ge)問題就(jiu)跟移(yi)(yi)(yi)液(ye)(ye)(ye)器和(he)實驗者(zhe)的(de)(de)操作(zuo)有(you)關(guan)了(le)。移(yi)(yi)(yi)液(ye)(ye)(ye)器的(de)(de)使用維護不規范(fan)，就(jiu)會(hui)造成移(yi)(yi)(yi)液(ye)(ye)(ye)的(de)(de)誤差較大(da)(da)；實驗者(zhe)自身的(de)(de)操作(zuo)習(xi)慣(guan)、加樣的(de)(de)一致(zhi)性對復孔(kong)的(de)(de)CV也有(you)很大(da)(da)影(ying)響。掌(zhang)握移(yi)(yi)(yi)液(ye)(ye)(ye)器的(de)(de)正確使用和(he)維護。關(guan)于個(ge)人的(de)(de)操作(zuo)可(ke)練習(xi)移(yi)(yi)(yi)液(ye)(ye)(ye)動作(zuo)、加快速度(du)，確保(bao)移(yi)(yi)(yi)液(ye)(ye)(ye)的(de)(de)精密度(du)。

5、本底偏高，樣本值測不到

標(biao)曲(qu)的(de)(de)本(ben)(ben)(ben)底即Blank孔的(de)(de)OD值一般要(yao)求控制在(zai)0.1以下(對于高敏ELISA可以適當放(fang)寬要(yao)求)。尤其是樣本(ben)(ben)(ben)值特別(bie)低的(de)(de)時候，本(ben)(ben)(ben)底過高會(hui)掩蓋(gai)目的(de)(de)信號，導致無法測到樣本(ben)(ben)(ben)值。在(zai)加入(ru)TMB顯(xian)(xian)色(se)后，需實時觀察(cha)標(biao)曲(qu)顯(xian)(xian)色(se)情(qing)況。通(tong)常在(zai)S5孔有肉眼可見的(de)(de)微弱藍色(se)，即可終止反應。

6、樣本經不同梯度稀釋，計算得到的樣本值差異較大

有時(shi)(shi)(shi)候(hou)我(wo)們(men)(men)不(bu)清楚(chu)樣(yang)本(ben)(ben)(ben)中目的(de)(de)(de)蛋白(bai)的(de)(de)(de)濃度如(ru)何，應(ying)該(gai)如(ru)何稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)(shi)，那(nei)么我(wo)們(men)(men)就會做(zuo)(zuo)下預實驗，確定稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)(shi)倍數。然而有時(shi)(shi)(shi)候(hou)同一樣(yang)本(ben)(ben)(ben)做(zuo)(zuo)了幾(ji)個(ge)不(bu)同梯(ti)度稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)(shi)后(hou)，計算得到(dao)的(de)(de)(de)樣(yang)本(ben)(ben)(ben)值(zhi)之間差(cha)異較大(da)，應(ying)該(gai)選擇哪一個(ge)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)(shi)倍數呢？這里涉及到(dao)了基(ji)質效(xiao)應(ying)。通(tong)常血清樣(yang)本(ben)(ben)(ben)加(jia)樣(yang)量較高時(shi)(shi)(shi)，血清中的(de)(de)(de)各(ge)種蛋白(bai)會抑(yi)制抗原抗體的(de)(de)(de)接(jie)觸(chu)，基(ji)質效(xiao)應(ying)較明顯。而經(jing)過(guo)(guo)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)(shi)后(hou)，干擾(rao)因素也隨之稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)(shi)，影(ying)響就會較小(xiao)。當某兩個(ge)梯(ti)度稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)(shi)后(hou)，計算得到(dao)的(de)(de)(de)樣(yang)本(ben)(ben)(ben)值(zhi)接(jie)近(jin)時(shi)(shi)(shi)，我(wo)們(men)(men)就可以認為在該(gai)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)(shi)梯(ti)度時(shi)(shi)(shi)，樣(yang)本(ben)(ben)(ben)中的(de)(de)(de)干擾(rao)因素影(ying)響較小(xiao)，計算得到(dao)的(de)(de)(de)值(zhi)也是接(jie)近(jin)真實的(de)(de)(de)。然而這樣(yang)的(de)(de)(de)稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)(shi)是針(zhen)對目的(de)(de)(de)蛋白(bai)濃度較高的(de)(de)(de)樣(yang)本(ben)(ben)(ben)而言。對于濃度很低的(de)(de)(de)樣(yang)本(ben)(ben)(ben)，經(jing)過(guo)(guo)多倍稀(xi)(xi)(xi)釋(shi)(shi)(shi)后(hou)，就更加(jia)測不(bu)到(dao)了，此時(shi)(shi)(shi)可按(an)照廠家(jia)說明書推薦的(de)(de)(de)加(jia)樣(yang)方(fang)式操作。

7、不同試劑盒中的組分能否通用

除非是公用(yong)的試(shi)劑(ji)如洗液、檢測(ce)緩沖液，其(qi)它(ta)組(zu)(zu)分(fen)不(bu)建議用(yong)其(qi)它(ta)試(shi)劑(ji)盒(he)的組(zu)(zu)分(fen)，甚(shen)至是同(tong)一指(zhi)標(biao)不(bu)同(tong)批次的試(shi)劑(ji)盒(he)里的組(zu)(zu)分(fen)。這些組(zu)(zu)分(fen)(包括標(biao)準(zhun)品、標(biao)準(zhun)品稀釋(shi)液、檢測(ce)抗體、酶等)都是經過(guo)優化(hua)的，如果貿(mao)然使用(yong)其(qi)它(ta)試(shi)劑(ji)盒(he)的組(zu)(zu)分(fen)，有(you)可能對結果產(chan)生影響。