PCR反應條件的選擇指南

　　PCR反應條件為:  溫度(du)、時間和循環次數。

　　溫(wen)(wen)度與(yu)(yu)時間的(de)設置： 基(ji)于(yu)PCR原理三(san)步驟而設置變性(xing)-退(tui)火-延伸三(san)個溫(wen)(wen)度點。在(zai)(zai)標準反應中采用(yong)三(san)溫(wen)(wen)度點法(fa)，雙鏈DNA在(zai)(zai)90～95℃變性(xing)，再(zai)迅速(su)冷(leng)卻(que)至(zhi)40 ～60℃，引(yin)物(wu)退(tui)火并(bing)結合到靶(ba)序列上，然后快速(su)升(sheng)溫(wen)(wen)至(zhi)70～75℃，在(zai)(zai)Taq DNA 聚合酶的(de)作(zuo)用(yong)下，使引(yin)物(wu)鏈沿模(mo)板延伸。對于(yu)較(jiao)短靶(ba)基(ji)因(長度為(wei)100～300bp時)可(ke)采用(yong)二溫(wen)(wen)度點法(fa)，除變性(xing)溫(wen)(wen)度外、退(tui)火與(yu)(yu)延伸溫(wen)(wen)度可(ke)合二為(wei)一(yi)(yi)，一(yi)(yi)般(ban)采用(yong)94℃變性(xing)，65℃左右退(tui)火與(yu)(yu)延伸(此溫(wen)(wen)度Taq DNA酶仍有較(jiao)高(gao)的(de)催化(hua)活性(xing))。

　　1. 變性溫度與時間：變(bian)性溫度低，解鏈不完全(quan)是導(dao)致PCR失(shi)敗的(de)最主要原因(yin)。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模(mo)(mo)板DNA變(bian)性，若低于93℃則需(xu)延長時間(jian)，但溫度不能(neng)過高，因(yin)為高溫環境(jing)對酶的(de)活性有(you)影響。此步(bu)若不能(neng)使靶基(ji)因(yin)模(mo)(mo)板或PCR產物完全(quan)變(bian)性，就(jiu)會導(dao)致PCR失(shi)敗。

　　2. 退火(復性)溫度與時間：退火(huo)溫(wen)(wen)度(du)(du)是(shi)影(ying)響PCR特異性(xing)的(de)較(jiao)重(zhong)要因(yin)素。變性(xing)后溫(wen)(wen)度(du)(du)快(kuai)速冷(leng)卻至40℃～60℃，可使(shi)引物(wu)和模(mo)板(ban)發(fa)生結合(he)。由于(yu)模(mo)板(ban)DNA 比引物(wu)復雜得多，引物(wu)和模(mo)板(ban)之間(jian)的(de)碰撞(zhuang)(zhuang)結合(he)機會(hui)遠遠高于(yu)模(mo)板(ban)互補(bu)鏈之間(jian)的(de)碰撞(zhuang)(zhuang)。退火(huo)溫(wen)(wen)度(du)(du)與時間(jian)，取決(jue)于(yu)引物(wu)的(de)長度(du)(du)、堿基(ji)組(zu)成(cheng)及(ji)其濃度(du)(du)，還有靶(ba)基(ji)序列的(de)長度(du)(du)。對(dui)于(yu)20個(ge)核苷酸，G+C含量約50%的(de)引物(wu)，55℃為選(xuan)擇最(zui)適退火(huo)溫(wen)(wen)度(du)(du)的(de)起(qi)點較(jiao)為理想。引物(wu)的(de)復性(xing)溫(wen)(wen)度(du)(du)可通(tong)過(guo)以(yi)下公式(shi)幫助(zhu)選(xuan)擇合(he)適的(de)溫(wen)(wen)度(du)(du)：

　　　　　Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復性溫度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允(yun)許范圍(wei)內， 選擇(ze)較(jiao)高(gao)(gao)的復(fu)性溫度可大(da)大(da)減少引(yin)物和模板(ban)間(jian)(jian)的非特(te)異(yi)性結合(he)，提高(gao)(gao)PCR反應的特(te)異(yi)性。復(fu)性時間(jian)(jian)一般為30～60sec，足以使(shi)引(yin)物與(yu)模板(ban)之間(jian)(jian)完全(quan)結合(he)。

　　3. 延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于(yu)90℃時(shi)， DNA合(he)成幾乎(hu)不能進行(xing)。

　　PCR反(fan)應的(de)(de)延(yan)伸溫度(du)一般選(xuan)擇在70～75℃之間(jian)(jian)，常用溫度(du)為72℃，過高的(de)(de)延(yan)伸溫度(du)不利于引物(wu)和模板的(de)(de)結合。PCR延(yan)伸反(fan)應的(de)(de)時間(jian)(jian)，可根(gen)據待擴(kuo)增(zeng)片(pian)段的(de)(de)長(chang)度(du)而定，一般1Kb以內的(de)(de)DNA片(pian)段，延(yan)伸時間(jian)(jian)1min是(shi)足(zu)夠的(de)(de)。3～4kb的(de)(de)靶序列需3～4min；擴(kuo)增(zeng)10Kb需延(yan)伸至15min。延(yan)伸進間(jian)(jian)過長(chang)會導(dao)致(zhi)非特異性擴(kuo)增(zeng)帶的(de)(de)出現。對低濃(nong)度(du)模板的(de)(de)擴(kuo)增(zeng)，延(yan)伸時間(jian)(jian)要稍(shao)長(chang)些(xie)。

　　循環次數:　　循(xun)(xun)(xun)環次數決定(ding)PCR擴(kuo)增(zeng)程(cheng)度(du)(du)。PCR循(xun)(xun)(xun)環次數主要取決于模板(ban)DNA的(de)濃度(du)(du)。一(yi)般的(de)循(xun)(xun)(xun)環次數選在30～40次之間，循(xun)(xun)(xun)環次數越多，非(fei)特異(yi)性產物的(de)量亦隨之增(zeng)多。