檢測蛋白質樣品中蛋白類雜質的方法

        蛋白類(lei)雜質(zhi)的(de)檢測方(fang)法(fa)(fa)(fa)，包括電泳法(fa)(fa)(fa)，色譜法(fa)(fa)(fa)，沉降速率測定法(fa)(fa)(fa)，質(zhi)譜法(fa)(fa)(fa)，光散射法(fa)(fa)(fa)。任何方(fang)法(fa)(fa)(fa)都不能直接(jie)定量蛋白質(zhi)樣品的(de)純度。無論(lun)最終目的(de)是為了解釋分析數據(ju)、驗證過程質(zhi)量，還是為了確保生(sheng)物制(zhi)劑產(chan)品的(de)安全性(xing)，樣品純度的(de)測定都是至關重要的(de)環節。

　　隨(sui)著蛋(dan)白類生物(wu)(wu)(wu)制品(pin)(pin)的(de)(de)(de)(de)發展，蛋(dan)白質(zhi)純(chun)度(du)已經成(cheng)為(wei)藥(yao)(yao)品(pin)(pin)管理(li)的(de)(de)(de)(de)重大問題(ti)。在生物(wu)(wu)(wu)制品(pin)(pin)的(de)(de)(de)(de)質(zhi)量指導原則中指出(chu)：除了(le)評價原料藥(yao)(yao)和藥(yao)(yao)物(wu)(wu)(wu)產(chan)品(pin)(pin)的(de)(de)(de)(de)純(chun)度(du)，可(ke)能(neng)由預期產(chan)品(pin)(pin)和多種產(chan)品(pin)(pin)相關物(wu)(wu)(wu)質(zhi)組成(cheng)之(zhi)外，還應評價可(ke)能(neng)出(chu)現的(de)(de)(de)(de)雜質(zhi)成(cheng)份。這些(xie)雜質(zhi)可(ke)能(neng)是(shi)在生產(chan)過(guo)程中產(chan)生的(de)(de)(de)(de)或者是(shi)與產(chan)品(pin)(pin)相關，它們的(de)(de)(de)(de)結構可(ke)能(neng)是(shi)已知的(de)(de)(de)(de)、定性的(de)(de)(de)(de)，亦或是(shi)未知的(de)(de)(de)(de)。

　　在(zai)評價樣品純(chun)度之前，首先要鑒定(ding)待(dai)(dai)測(ce)雜(za)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)類(lei)型(xing)，如(ru)核(he)酸(suan)、碳水化合(he)物(wu)、脂質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)、無關蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)、同工酶類(lei)、失活蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)，進(jin)而(er)確(que)定(ding)在(zai)待(dai)(dai)測(ce)溶(rong)液中(zhong)，能夠區(qu)分(fen)假定(ding)雜(za)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)和目(mu)標蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)理化性(xing)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(化學分(fen)析或(huo)物(wu)理特征)。純(chun)化過程中(zhong)可(ke)能已將某一雜(za)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)濃度降低到(dao)檢(jian)測(ce)限以(yi)下(xia)，但色譜(pu)峰中(zhong)還有(you)殘留。毫無疑問，表觀純(chun)度取決于所選擇的(de)測(ce)定(ding)方法(fa)及其靈敏(min)度。大多數的(de)分(fen)離方法(fa)都能有(you)效(xiao)的(de)去除非(fei)蛋(dan)白(bai)類(lei)雜(za)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)，下(xia)面簡單介紹蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)樣品中(zhong)蛋(dan)白(bai)類(lei)雜(za)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)檢(jian)測(ce)方法(fa)。

　　1、電泳法

        電泳法最(zui)簡單、成(cheng)本最(zui)低，并且在確定樣(yang)品中蛋白質(zhi)(zhi)組(zu)分(fen)(fen)數(shu)目方(fang)面(mian)靈敏度最(zui)高，因此最(zui)為常見。通常被用于蛋白質(zhi)(zhi)純(chun)度鑒(jian)(jian)定的第一步篩選，甚至應用于初期(qi)高異質(zhi)(zhi)性(xing)的樣(yang)品鑒(jian)(jian)定。如果預期(qi)雜質(zhi)(zhi)與目標蛋白的分(fen)(fen)子(zi)量有(you)差距，SDS凝(ning)膠(jiao)電泳可以(yi)分(fen)(fen)辨(bian)出(chu)雜質(zhi)(zhi)。對(dui)于分(fen)(fen)子(zi)量相近但氨基酸組(zu)成(cheng)不同(tong)的分(fen)(fen)子(zi)，SDS凝(ning)膠(jiao)電泳一般分(fen)(fen)不開(kai)，但在非變性(xing)凝(ning)膠(jiao)電泳中可以(yi)根據其(qi)不同(tong)的電泳遷移率進行(xing)鑒(jian)(jian)定。

　　然而，在(zai)采(cai)用該方(fang)法(fa)時也需要注意一(yi)些潛在(zai)的(de)問題(ti)。對于變性(xing)凝(ning)膠(jiao)(jiao)，可(ke)(ke)能(neng)出(chu)現假陰性(xing)和假陽(yang)性(xing)現象。如果發生雜(za)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)共(gong)遷移或(huo)雜(za)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)無法(fa)進入凝(ning)膠(jiao)(jiao)的(de)情況，會出(chu)現假陰性(xing)。因此應該將(jiang)整(zheng)塊(kuai)膠(jiao)(jiao)，包括濃縮膠(jiao)(jiao)和分(fen)離膠(jiao)(jiao)都染(ran)色，并且需要檢驗(yan)蛋(dan)白質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)燃料(liao)是(shi)否(fou)合適(shi)。而假陽(yang)性(xing)的(de)產(chan)生，可(ke)(ke)能(neng)是(shi)由于在(zai)樣品(pin)制(zhi)備時發生共(gong)價修飾，或(huo)者(zhe)膠(jiao)(jiao)不(bu)均(jun)一(yi)或(huo)氧化劑殘留。同時在(zai)非變性(xing)凝(ning)膠(jiao)(jiao)中也會出(chu)現類似問題(ti)。如果雜(za)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)的(de)靜電荷(he)為零或(huo)者(zhe)與目標(biao)蛋(dan)白相反，雜(za)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)將(jiang)不(bu)會出(chu)現在(zai)膠(jiao)(jiao)上，可(ke)(ke)以通過加寬非變性(xing)凝(ning)膠(jiao)(jiao)電泳的(de)PH范圍(wei)來解決。

　　2、色譜法

　　2.1 凝膠過濾色譜法

　　凝(ning)膠(jiao)過(guo)濾色譜法是檢測與目的(de)蛋白分(fen)子量大(da)小不(bu)同雜質(zhi)的(de)最簡單方(fang)法之一(yi)。此(ci)方(fang)法無破壞性(xing)并(bing)且非常快速。因為此(ci)方(fang)法為樣品區分(fen)法，樣品通(tong)過(guo)凝(ning)膠(jiao)柱時會(hui)被稀釋，因此(ci)檢測的(de)樣品需要有(you)一(yi)定(ding)的(de)起(qi)始濃度。而具體的(de)檢測量則取決于檢測雜質(zhi)時的(de)靈敏(min)度。

　　凝(ning)膠(jiao)(jiao)過濾(lv)色譜法(fa)(fa)檢測分(fen)子大小(xiao)的(de)靈敏度低于電泳(yong)(yong)法(fa)(fa)，實(shi)驗需要的(de)材料量(liang)大于電泳(yong)(yong)法(fa)(fa)。由于凝(ning)膠(jiao)(jiao)過濾(lv)色譜通常在(zai)天然狀態下進(jin)行，結果(guo)可(ke)以反映樣(yang)品的(de)異(yi)質(zhi)性(xing)。但(dan)如果(guo)蛋(dan)白(bai)質(zhi)以穩(wen)定的(de)寡聚物形式存在(zai)(如脂肪酸酶)，在(zai)凝(ning)膠(jiao)(jiao)過濾(lv)色譜時將表現(xian)出(chu)異(yi)質(zhi)性(xing)。同時，快速、可(ke)逆自(zi)聯(lian)作用的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)也會表現(xian)出(chu)異(yi)常濃度的(de)洗脫譜。在(zai)出(chu)現(xian)這樣(yang)情況的(de)時候，可(ke)以從不(bu)對稱或(huo)加寬峰中選取不(bu)同部分(fen)來重復凝(ning)膠(jiao)(jiao)過濾(lv)色譜。

　　2.2 反相高效液相色譜法

　　反(fan)相高效液相色(se)譜法（reversed phase HPLC），是利(li)用如改性(xing)硅介質等非極(ji)性(xing)基質作為(wei)固定相，通過流(liu)動相中(zhong)的(de)有(you)機溶劑減少了蛋白質與固定相的(de)親(qin)和力(li)，進行極(ji)性(xing)遞(di)減的(de)梯度洗(xi)脫，從而將蛋白洗(xi)脫下來。

　　由于(yu)該方(fang)法(fa)簡(jian)單并且迅速，同(tong)(tong)時(shi)有現成的(de)儀器設備(bei)，能夠(gou)靈活應用于(yu)多種不同(tong)(tong)特性的(de)蛋白質(zhi)分(fen)離(li)，因此此方(fang)法(fa)已(yi)普(pu)遍(bian)用于(yu)蛋白質(zhi)樣品(pin)的(de)純度測定(ding)。如(ru)果(guo)有需(xu)要，還可以通(tong)過(guo)改變流動相使樣品(pin)在不同(tong)(tong)梯度及條件(jian)下(xia)分(fen)離(li)，來確定(ding)主要目(mu)標物的(de)純度。

　　3、沉降速率測定法

　　沉(chen)降速度(du)法，能夠簡單并且快(kuai)速非破壞性的(de)(de)來測定(ding)蛋白(bai)質(zhi)的(de)(de)純度(du)，同時對(dui)分子(zi)質(zhi)量(liang)(liang)和分子(zi)大小(xiao)的(de)(de)比值非常靈(ling)敏。該方法的(de)(de)優點在于(yu)，測定(ding)范圍(wei)非常的(de)(de)廣；但局(ju)限在于(yu)，對(dui)相對(dui)分子(zi)質(zhi)量(liang)(liang)相差小(xiao)的(de)(de)樣品(pin)做測定(ding)時，靈(ling)敏度(du)低于(yu)電泳技術。

　　4、質譜法

　　質(zhi)(zhi)(zhi)譜(pu)法(fa)(fa)(fa)可(ke)以直接測定(ding)(ding)一個樣品(pin)中共價質(zhi)(zhi)(zhi)量的(de)(de)分(fen)(fen)布，此方(fang)法(fa)(fa)(fa)能夠方(fang)便簡便、靈(ling)敏(min)的(de)(de)測定(ding)(ding)雜(za)質(zhi)(zhi)(zhi)。質(zhi)(zhi)(zhi)譜(pu)法(fa)(fa)(fa)不(bu)僅可(ke)以檢測雜(za)質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)存在，還可(ke)以描述雜(za)質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)質(zhi)(zhi)(zhi)量特(te)征，因此質(zhi)(zhi)(zhi)譜(pu)法(fa)(fa)(fa)常被用(yong)(yong)于鑒定(ding)(ding)雜(za)質(zhi)(zhi)(zhi)的(de)(de)來(lai)源(yuan)。通(tong)過串(chuan)聯質(zhi)(zhi)(zhi)譜(pu)法(fa)(fa)(fa)（MS/MS），可(ke)以鑒定(ding)(ding)共價改(gai)性修飾(shi)特(te)征和位點(dian)。由(you)于雜(za)質(zhi)(zhi)(zhi)可(ke)能與主要目標物有相似的(de)(de)質(zhi)(zhi)(zhi)荷比，將質(zhi)(zhi)(zhi)譜(pu)法(fa)(fa)(fa)與其他方(fang)法(fa)(fa)(fa)(如凝膠分(fen)(fen)離色譜(pu))聯用(yong)(yong)，可(ke)以增(zeng)加樣品(pin)純度測定(ding)(ding)的(de)(de)準確性，達到最佳的(de)(de)效果。

　　5、光散射法

　　目(mu)前一些儀(yi)器能(neng)夠通(tong)(tong)過靜態或動(dong)態光散(san)射(she)來(lai)測(ce)定(ding)(ding)單(dan)個樣品(pin)，或者監(jian)測(ce)高效液(ye)相色(se)譜和場級分(fen)(fen)(fen)離過程。通(tong)(tong)過對分(fen)(fen)(fen)子(zi)大小(xiao)和表觀分(fen)(fen)(fen)子(zi)質量的(de)連續測(ce)定(ding)(ding)，增(zeng)強鑒(jian)定(ding)(ding)洗脫蛋(dan)白質的(de)能(neng)力，以(yi)區分(fen)(fen)(fen)待分(fen)(fen)(fen)析(xi)物(wu)、待分(fen)(fen)(fen)析(xi)物(wu)的(de)多(duo)聚體(ti)或雜質。光散(san)射(she)法(fa)非常簡單(dan)且無破壞性，同(tong)時(shi)能(neng)夠提供(gong)洗脫時(shi)間函數(shu)的(de)分(fen)(fen)(fen)子(zi)質量圖。如果(guo)紫外檢測(ce)峰不(bu)對稱，通(tong)(tong)過多(duo)角度(du)光散(san)射(she)（multiple angle light scattering，MALS）分(fen)(fen)(fen)析(xi)，有可能(neng)表現(xian)峰的(de)主要(yao)部分(fen)(fen)(fen)表觀分(fen)(fen)(fen)子(zi)量為(wei)mol/L，而邊(bian)緣為(wei)2mol/L，說(shuo)明可能(neng)存(cun)在二聚體(ti)。但(dan)出現(xian)倍(bei)數(shu)分(fen)(fen)(fen)子(zi)質量不(bu)一定(ding)(ding)能(neng)證(zheng)明一定(ding)(ding)存(cun)在自(zi)身結合，還(huan)需要(yao)采用不(bu)同(tong)的(de)方法(fa)驗證(zheng)此結果(guo)。

　　任何(he)方法(fa)都(dou)不能直接(jie)定(ding)(ding)量(liang)蛋白質(zhi)樣(yang)品(pin)的(de)純度(du)(du)。通常情況下，蛋白質(zhi)純度(du)(du)測定(ding)(ding)涉及評價待定(ding)(ding)雜(za)質(zhi)的(de)含量(liang)或僅僅驗證(zheng)蛋白質(zhi)樣(yang)品(pin)中是(shi)否存(cun)在雜(za)質(zhi)。無論最終(zhong)目的(de)是(shi)為(wei)了(le)解釋分析(xi)數據、驗證(zheng)過程質(zhi)量(liang)，還(huan)是(shi)為(wei)了(le)確(que)保生物制劑產品(pin)的(de)安全(quan)性，樣(yang)品(pin)純度(du)(du)的(de)測定(ding)(ding)都(dou)是(shi)至關重要的(de)環節。