ELISA試劑盒關鍵操作步驟解析

      在(zai)(zai)進行酶聯免疫吸附劑測(ce)定(ding)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）實驗中，有(you)很多(duo)需要(yao)注意的(de)地方，由于ELISA方法廣泛應(ying)用在(zai)(zai)各種(zhong)抗原和抗體的(de)此定(ding)中。但是測(ce)定(ding)中的(de)影(ying)響因(yin)素(su)很多(duo)，并且對(dui)操(cao)作有(you)較高的(de)要(yao)求，所以，在(zai)(zai)實驗中除了正常的(de)相(xiang)互反(fan)應(ying)，還(huan)會出(chu)現錯(cuo)誤的(de)反(fan)應(ying)，導致錯(cuo)誤的(de)結果。 無論在(zai)(zai)什么(me)研究(jiu)中，優質的(de)試劑、良(liang)好的(de)和正確(que)的(de)操(cao)作是保(bao)證(zheng)ELISA 檢測(ce)結果準(zhun)確(que)可(ke)靠的(de)必要(yao)條件。

1、標本的采取和保存

大部分ELISA 檢測均以血清為標本。血清標本可按常規方法采集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以HRP 為標記的ELISA 測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，也會產生假陽性反應。一般說來，在5 天內測定的血清標本可放置于4℃，標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG 聚合，使間接法的試劑本底加深。超過一周測定的需－20℃保存。凍結血清融解后，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻并避免產生氣泡。混濁或有沉淀的血清標本應先離心或過濾，澄清后再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。
保存血清自采集時就應注意無菌操作，也可加入適當防腐劑。
抗凝不(bu)完全的(de)標(biao)本因纖維蛋白原的(de)干擾而(er)造成假(jia)陽性，建議盡量(liang)不(bu)用抗凝血尤其是肝(gan)素抗凝劑。

2、加樣   

加樣時應將所加物加在ELISA 板孔的底部(bu)(bu)，避免加在孔壁上部(bu)(bu)，并(bing)注(zhu)意不可(ke)濺出。

3、 保溫

在建立ELISA 方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2
小時，產物的(de)生成(cheng)(cheng)可達頂(ding)峰。為避免蒸發(fa)，板(ban)(ban)上應(ying)加蓋(gai)，也(ye)可用塑(su)料貼封紙或保鮮膜覆(fu)蓋(gai)板(ban)(ban)孔(kong)，反應(ying)板(ban)(ban)不宜疊放(fang)，以保證各(ge)板(ban)(ban)的(de)溫度都能迅速平(ping)衡。應(ying)注意溫育的(de)溫度和時間應(ying)按規定力求準確(que)。由(you)于公司的(de)試劑盒(he)溫育是在(zai)空氣浴中(zhong)(zhong)完成(cheng)(cheng)，采(cai)用水浴會造成(cheng)(cheng)值(zhi)偏(pian)高或花板(ban)(ban)。另外溫育中(zhong)(zhong)還有(you)邊緣效應(ying)，邊上的(de)值(zhi)會偏(pian)高，建議為了客觀的(de)判斷(duan)結(jie)果(guo)，將質控放(fang)在(zai)非邊緣位置。

4、 洗滌

洗滌在ELISA 試劑盒過程中雖不是一個反應步驟，但卻決定著實驗的成敗。ELSIA 就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。可以說在ELISA 操作中，洗滌是最主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。 洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
洗(xi)(xi)(xi)板(ban)時(shi)注意各(ge)種試劑(ji)盒的(de)(de)(de)洗(xi)(xi)(xi)液(ye)不(bu)要(yao)(yao)混用(yong)。如果洗(xi)(xi)(xi)液(ye)需要(yao)(yao)稀釋，應(ying)(ying)按要(yao)(yao)求(qiu)稀釋，所(suo)用(yong)的(de)(de)(de)水電(dian)導(dao)率最(zui)好在1.5us/cm 之(zhi)下，洗(xi)(xi)(xi)液(ye)如果結晶應(ying)(ying)待其(qi)融解后(hou)配制。保證洗(xi)(xi)(xi)板(ban)浸泡時(shi)間為40 秒(miao)左(zuo)右，孔內(nei)液(ye)體被洗(xi)(xi)(xi)板(ban)機吸(xi)收(shou)得(de)越(yue)干(gan)凈洗(xi)(xi)(xi)滌(di)效果更好，手工洗(xi)(xi)(xi)板(ban)防止(zhi)(zhi)洗(xi)(xi)(xi)液(ye)在孔內(nei)形成(cheng)氣(qi)泡。E 顯色(se)(se)和(he)(he)比色(se)(se) TMB 經HRP 作(zuo)用(yong)后(hou)，約40 分鐘(zhong)顯色(se)(se)達(da)頂(ding)峰，隨即(ji)逐漸減弱，至2 小(xiao)時(shi)后(hou)即(ji)可完全消退(tui)至無色(se)(se)。TMB 的(de)(de)(de)終(zhong)止(zhi)(zhi)液(ye)有多種，疊氮鈉和(he)(he)十(shi)二烷(wan)基硫酸鈉（SDS）等(deng)酶抑制劑(ji)均可使反應(ying)(ying)終(zhong)止(zhi)(zhi)。這類終(zhong)止(zhi)(zhi)劑(ji)尚能使藍(lan)色(se)(se)維持較長時(shi)間（12-24 小(xiao)時(shi)）不(bu)褪，是目視判斷的(de)(de)(de)良(liang)好終(zhong)止(zhi)(zhi)劑(ji)。此(ci)外，各(ge)類酸性終(zhong)止(zhi)(zhi)液(ye)則會使藍(lan)色(se)(se)轉(zhuan)變成(cheng)黃色(se)(se)，此(ci)時(shi)可用(yong)特定的(de)(de)(de)波(bo)(bo)長（450nm）測(ce)(ce)(ce)讀(du)(du)(du)(du)吸(xi)光值。酶標(biao)(biao)比色(se)(se)儀(yi)簡(jian)稱酶標(biao)(biao)儀(yi)，通常指(zhi)專(zhuan)用(yong)于測(ce)(ce)(ce)讀(du)(du)(du)(du)ELISA 結果吸(xi)光度(du)(du)(du)的(de)(de)(de)光度(du)(du)(du)計。酶標(biao)(biao)儀(yi)的(de)(de)(de)主要(yao)(yao)性能指(zhi)標(biao)(biao)有：測(ce)(ce)(ce)讀(du)(du)(du)(du)速度(du)(du)(du)、讀(du)(du)(du)(du)數的(de)(de)(de)準確(que)性、重復性、精(jing)確(que)度(du)(du)(du)和(he)(he)可測(ce)(ce)(ce)范圍、線性等(deng)等(deng)。優(you)良(liang)的(de)(de)(de)酶標(biao)(biao)儀(yi)的(de)(de)(de)讀(du)(du)(du)(du)數一般可精(jing)確(que)到0.001，準確(que)性為±1%，重復性達(da)0.5%。酶標(biao)(biao)儀(yi)不(bu)應(ying)(ying)安置在陽光或(huo)強(qiang)光照射下，操作(zuo)時(shi)室(shi)溫宜在15~30℃，使用(yong)前先(xian)預熱儀(yi)器(qi)15-30 分鐘(zhong)，測(ce)(ce)(ce)讀(du)(du)(du)(du)結果更穩定。 測(ce)(ce)(ce)讀(du)(du)(du)(du)A 值時(shi)，要(yao)(yao)選用(yong)產(chan)物的(de)(de)(de)敏感吸(xi)收(shou)峰，如OPD 用(yong)492nm 波(bo)(bo)長。有的(de)(de)(de)酶標(biao)(biao)儀(yi)可用(yong)雙波(bo)(bo)長式測(ce)(ce)(ce)讀(du)(du)(du)(du)，即(ji)每孔先(xian)后(hou)測(ce)(ce)(ce)讀(du)(du)(du)(du)兩(liang)次，第(di)一次在最(zui)適波(bo)(bo)長（W1），第(di)二次在不(bu)敏感波(bo)(bo)長（W2），兩(liang)次測(ce)(ce)(ce)定間不(bu) 移(yi)動ELISA 板(ban)的(de)(de)(de)位置，最(zui)終(zhong)測(ce)(ce)(ce)得(de)的(de)(de)(de)A 值為兩(liang)者(zhe)之(zhi)差（W1-W2）。雙波(bo)(bo)長式測(ce)(ce)(ce)讀(du)(du)(du)(du)可減少由容器(qi)上的(de)(de)(de)劃痕(hen)或(huo)指(zhi)印等(deng)造(zao)成(cheng)的(de)(de)(de)光干(gan)擾。