ELISA實驗成功注意事項匯總

    ELISA是酶聯接免疫(yi)吸附劑(ji)測(ce)定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的(de)簡稱。它是繼免疫(yi)熒(ying)光和放射免疫(yi)技(ji)術之后(hou)發(fa)展起來的(de)一(yi)種免疫(yi)酶技(ji)術。作為經典的(de)免疫(yi)檢測(ce)方法，看起來很平常，然而(er)真正做(zuo)好(hao)成功(gong)它并不容(rong)易(yi)。總結以下(xia)注意事項(xiang)：

 1. 確定您的樣本類(lei)型和(he)試劑盒可以兼容

  常見樣本類型有血清，血漿，細胞培養上清，如果是廠家實驗驗證過的，可根據產品說明購買使用。【注意：血漿制備用到的抗凝劑有 EDTA、檸檬酸鹽、肝素等多種，相應的血漿性質存在差異，需單獨確認兼容性。

 2. 試劑盒檢測范圍需要匹配樣本中標志物濃度

  elisa試劑盒的(de)定(ding)量檢測(ce)(ce)范(fan)(fan)圍需(xu)參考標(biao)準曲線(xian)(xian)，在標(biao)準曲線(xian)(xian)低(di)和高濃(nong)度(du)(du)區間(jian)內(nei)屬(shu)于線(xian)(xian)性(xing)范(fan)(fan)圍，其(qi)中(zhong)的(de)值(zhi)是(shi)可信和可定(ding)量的(de)。濃(nong)度(du)(du)高于線(xian)(xian)性(xing)范(fan)(fan)圍的(de)樣(yang)品要稀釋(shi)到(dao)線(xian)(xian)性(xing)范(fan)(fan)圍內(nei)來測(ce)(ce)量，而濃(nong)度(du)(du)低(di)于線(xian)(xian)性(xing)范(fan)(fan)圍的(de)樣(yang)品，其(qi)測(ce)(ce)量值(zhi)不能(neng)用于計算(suan)濃(nong)度(du)(du)，只(zhi)能(neng)用做參考。有一(yi)種常見的(de)相關情況(kuang)是(shi)：健康人樣(yang)本中(zhong)很多標(biao)志(zhi)物的(de)濃(nong)度(du)(du)偏低(di)，測(ce)(ce)量值(zhi)低(di)于標(biao)準曲線(xian)(xian)低(di)值(zhi)。

 3. 樣本收集有講究

  以(yi)血清(qing)為(wei)例，樣(yang)本(ben)收集可(ke)參考試(shi)劑盒說明書，但(dan)需注(zhu)意以(yi)下要點。樣(yang)本(ben)盡量(liang)用(yong)(yong)無菌(jun)(jun)管(guan)收集，避(bi)(bi)(bi)免(mian)細(xi)菌(jun)(jun)的酶類和代謝(xie)產(chan)品(pin)對結果(guo)的影(ying)響(xiang)(xiang)。采集過程(cheng)要避(bi)(bi)(bi)免(mian)溶血，因(yin)為(wei)紅(hong)細(xi)胞溶解(jie)釋放的活(huo)性物質可(ke)能(neng)會影(ying)響(xiang)(xiang)檢測(ce)。保(bao)存(cun)過程(cheng)中如(ru)有(you)沉淀，應離心后取上清(qing)液。樣(yang)本(ben)若不立即(ji)測(ce)定，建議按照(zhao)每(mei)(mei)次(ci)使用(yong)(yong)量(liang)分裝保(bao)存(cun)在(zai) -20℃，每(mei)(mei)次(ci)檢測(ce)使用(yong)(yong)一管(guan)，即(ji)避(bi)(bi)(bi)免(mian)交叉污染和反復(fu)凍融，有(you)能(neng)保(bao)證檢測(ce)結果(guo)的平(ping)行可(ke)比性。

 4. 實驗前要準備好相應試劑

  提前將所有試劑平衡到室溫環境，這個(ge)過程(cheng)大致需(xu)半小時(shi)左右(you)。洗液(ye)(ye)是濃縮液(ye)(ye)，如有結晶(jing)析(xi)出，需(xu)完全溶解后再進行稀釋。A、B 兩管顯色底物在(zai)使用(yong)前15分鐘按(an) 1:1 配(pei)成混合(he)液(ye)(ye)。為保證蛋(dan)白(bai)標準(zhun)品溶液(ye)(ye)配(pei)制質量(liang)，蛋(dan)白(bai)標準(zhun)品為凍(dong)干(gan)粉，重溶前需(xu)將管子離(li)心，加入說明書的緩沖液(ye)(ye)，慢速在(zai)搖床上搖勻或顛倒混勻，至(zhi)少 15 分鐘，不(bu)建議(yi)用(yong)槍頭吹打(da)。溶解后如需(xu)保存，按(an)每次使用(yong)量(liang)分裝后根據說明書要求的溫度(du)保存。梯度(du)稀釋蛋(dan)白(bai)標準(zhun)品時(shi)，建議(yi)用(yong)聚丙烯管（對蛋(dan)白(bai)吸附力很低），每步都要充分混勻且換(huan)新(xin)槍頭，確保梯度(du)準(zhun)確性。

 5. 儀器設備的準備

  相關設(she)備包括移液器(qi)、洗板機/搖床(chuang)和酶標(biao)儀(yi)。移液器(qi)的(de)準確(que)性對于ELISA實(shi)驗結果(guo)的(de)可靠(kao)性十(shi)分關鍵，需要(yao)確(que)保定(ding)(ding)期校準維護。搖床(chuang)的(de)使(shi)用(yong)是為了讓反應體系(xi)快速達(da)到平衡，獲得穩定(ding)(ding)、可重復的(de)結果(guo)。不用(yong)搖床(chuang)對實(shi)驗通(tong)常的(de)影(ying)響是，OD 值低，CV 大。酶標(biao)儀(yi)等設(she)備使(shi)用(yong)前(qian)提前(qian) 15 分鐘(zhong)開機預熱。

 6. 剩余的試劑盒材料要妥善保存

  標(biao)準品分裝后(hou)按說(shuo)明(ming)書(shu)要(yao)求(qiu)的溫(wen)度(du)保(bao)(bao)(bao)存(cun)，這樣可(ke)以避免污染，對要(yao)求(qiu)冷凍保(bao)(bao)(bao)存(cun)的標(biao)準品還可(ke)以避免反復凍融(rong)；酶標(biao)板(ban)放回錫(xi)箔(bo)紙袋，加入干燥劑，封(feng)緊(jin)封(feng)口，4℃保(bao)(bao)(bao)存(cun)。忌(ji)未將酶標(biao)板(ban)完(wan)全平衡至室溫(wen)，就放回錫(xi)箔(bo)紙袋，因為(wei)此時由于溫(wen)度(du)差，酶標(biao)板(ban)上會有(you)水汽，不利于穩定保(bao)(bao)(bao)存(cun)。

 7. 預實驗：通常預實驗包括全部標準曲線和小量樣本。

  預實驗有(you)兩個主要目的，一(yi)來是熟悉實驗流程，發現可能忽(hu)略的問題；二來是測(ce)試(shi)樣(yang)本和(he)試(shi)劑盒是否匹配，一(yi)旦出現不(bu)匹配的情況，不(bu)至于浪費過多(duo)樣(yang)本。另外是對(dui)樣(yang)品中目的分析物的豐度(du)作一(yi)下大致了解，以(yi)確定(ding)合適稀釋度(du)。

 8. 加樣要快速準確，避免氣泡

  加(jia)樣(yang)時間宜(yi)控(kong)制(zhi)在 15 分鐘內。加(jia)樣(yang)前要將樣(yang)本(ben)(ben)混勻(yun)，特別是凍存后融化的樣(yang)本(ben)(ben)（自然融化的血清(qing)等樣(yang)本(ben)(ben)會(hui)有分層現象），應(ying)上下顛倒充分混勻(yun)，注(zhu)意(yi)動作輕緩，避(bi)免產生(sheng)氣(qi)泡(pao)。如凍存融化后的樣(yang)本(ben)(ben)有沉淀，可以(yi)再(zai)次(ci)離心。整個加(jia)樣(yang)過程都要注(zhu)意(yi)避(bi)免產生(sheng)氣(qi)泡(pao)。氣(qi)泡(pao)會(hui)影(ying)響蛋白的相互結(jie)合，而影(ying)響反應(ying)進(jin)行。

 9. 孵育時要保證溫度均勻，防止揮發變干

  孵育(yu)時(shi)(shi)壓緊封口(kou)膜。多塊(kuai)板一(yi)起實(shi)驗時(shi)(shi)，要(yao)(yao)平放(fang)各板，不(bu)要(yao)(yao)疊放(fang)，以免因溫度不(bu)均造成漂移或邊緣效應。

 10. 手動洗板的操作指南

  加(jia)洗(xi)液(ye)(ye)要快速(su)，沒(mei)有多道移液(ye)(ye)器(qi)可以使(shi)用洗(xi)瓶。洗(xi)液(ye)(ye)應(ying)新鮮配制，以免被其他試劑污染，或(huo)染菌。加(jia)好洗(xi)液(ye)(ye)后浸泡 30s-1min。甩板(ban)倒液(ye)(ye)要迅(xun)速(su)干脆。倒液(ye)(ye)后在吸(xi)水紙上拍(pai)板(ban)，選用無(wu)粉塵和碎(sui)屑(xie)的吸(xi)水紙。需要用力拍(pai)板(ban)，使(shi)孔內(nei)沒(mei)有可見(jian)液(ye)(ye)體掛(gua)壁(bi)；但也不能太(tai)重(zhong)，不能讓樣品干太(tai)久。酶標板(ban)拍(pai)干后立(li)即做后續的加(jia)液(ye)(ye)。

 11. 顯色反應的關鍵點

  elisa試(shi)劑盒實驗(yan)是(shi)(shi)個酶促底物(wu)顯(xian)色反(fan)(fan)應(ying)，隨時(shi)間(jian)增(zeng)加，顯(xian)色變(bian)深，所(suo)以(yi)選(xuan)擇佳時(shi)間(jian)終(zhong)(zhong)止(zhi)反(fan)(fan)應(ying)是(shi)(shi)得到準確(que)的標(biao)準曲線和(he)樣(yang)本(ben)濃度(du)(du)的重要(yao)因素。終(zhong)(zhong)止(zhi)過(guo)程(cheng)(cheng)要(yao)完全。使用(yong)的 TMB 底物(wu)時(shi)完全終(zhong)(zhong)止(zhi)點是(shi)(shi)黃色，不會有任(ren)何(he)程(cheng)(cheng)度(du)(du)的藍色或(huo)綠色，終(zhong)(zhong)止(zhi)過(guo)程(cheng)(cheng)中必(bi)要(yao)時(shi)可以(yi)震蕩 96 孔板(ban)，或(huo)用(yong)槍頭抽(chou)吸混勻（終(zhong)(zhong)止(zhi)液含強酸，避免腐蝕(shi)）。