增加PCR特異性的引物特點

        細心地進行引物設計是PCR中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。下面的指導描述了一個可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點：
1、典型的(de)(de)引(yin)(yin)物18到24個核(he)苷長(chang)。引(yin)(yin)物需要足夠長(chang)，保證序(xu)列(lie)獨特(te)性，并降(jiang)低(di)序(xu)列(lie)存在(zai)于(yu)非(fei)目的(de)(de)序(xu)列(lie)位點的(de)(de)可能性。但是長(chang)度(du)大于(yu)24核(he)苷的(de)(de)引(yin)(yin)物并不意味著更高的(de)(de)特(te)異(yi)性。較長(chang)的(de)(de)序(xu)列(lie)可能會與錯誤配對序(xu)列(lie)雜交，降(jiang)低(di)了(le)特(te)異(yi)性，而(er)且比短序(xu)列(lie)雜交慢，從而(er)降(jiang)低(di)了(le)產(chan)量。

2、選擇(ze)GC含(han)(han)量為40％到60％或GC含(han)(han)量映像模板(ban)GC含(han)(han)量的引(yin)物。

3、設計5'端和中間區為G或C的(de)(de)(de)引(yin)物(wu)。這會增加引(yin)物(wu)的(de)(de)(de)穩(wen)定(ding)性和引(yin)物(wu)同目的(de)(de)(de)序(xu)列雜(za)交的(de)(de)(de)穩(wen)定(ding)性。

4、避免引(yin)物對(dui)3'末端存在互補序列(lie)，這會形成引(yin)物二聚體，抑(yi)制擴增。

5、避免(mian)3'末端富含GC。設計引物時保證在最(zui)后5個(ge)核苷中含有(you)3個(ge)A或T。

6、避免3'末端的(de)錯誤配對。3'端核苷需要同模板退(tui)火以供聚合酶催(cui)化延伸。

7、避(bi)免存在可能會(hui)產生(sheng)內(nei)部二級結構的序列，這會(hui)破(po)壞引物退火穩(wen)定性。

目的(de)(de)序列(lie)(lie)上并不(bu)存(cun)在的(de)(de)附加序列(lie)(lie)，如(ru)限制位點和啟動子序列(lie)(lie)，可以加入到引物(wu)5'端而不(bu)影響特異性。當計算引物(wu)Tm值時并不(bu)包括這些序列(lie)(lie)，但是應該對其進行互補性和內部二級結構的(de)(de)檢(jian)測。

有(you)時候，對于引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)設計(ji)僅了(le)解有(you)限的(de)(de)(de)(de)(de)序(xu)列信息。比(bi)如(ru)，如(ru)果(guo)僅知道(dao)氨基(ji)酸序(xu)列，可(ke)以(yi)設計(ji)兼(jian)(jian)并(bing)引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)。兼(jian)(jian)并(bing)引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)是指代表編(bian)碼(ma)單個氨基(ji)酸所(suo)有(you)不(bu)同(tong)(tong)堿基(ji)可(ke)能性的(de)(de)(de)(de)(de)不(bu)同(tong)(tong)序(xu)列的(de)(de)(de)(de)(de)混合物(wu)(wu)(wu)(wu)。為了(le)增(zeng)加特異性，可(ke)以(yi)參考密(mi)碼(ma)子(zi)使用表，根據不(bu)同(tong)(tong)生(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)堿基(ji)使用偏(pian)好，減少兼(jian)(jian)并(bing)性。次黃嘌呤可(ke)以(yi)同(tong)(tong)所(suo)有(you)的(de)(de)(de)(de)(de)堿基(ji)配對，降低引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)退火溫度。不(bu)要(yao)在引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)3'端使用兼(jian)(jian)并(bing)堿基(ji)，因為3'端最后3個堿基(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)退火足以(yi)在錯誤位點起始PCR。使用較(jiao)高的(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)濃度（1μM到3μM），因為許多兼(jian)(jian)并(bing)混合物(wu)(wu)(wu)(wu)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)引(yin)物(wu)(wu)(wu)(wu)不(bu)是特異性針對目的(de)(de)(de)(de)(de)模板。