增加PCR特異性的引物特點

        細心地進行引物設計是PCR中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。下面的指導描述了一個可以增加特異性的引物所具有的令人滿意的特點：
1、典型的(de)引(yin)物18到(dao)24個核苷長。引(yin)物需要足(zu)夠長，保證序(xu)列獨特(te)(te)性(xing)，并降低序(xu)列存在(zai)于(yu)非目的(de)序(xu)列位點的(de)可能(neng)(neng)性(xing)。但是(shi)長度大于(yu)24核苷的(de)引(yin)物并不意味著(zhu)更高的(de)特(te)(te)異(yi)性(xing)。較長的(de)序(xu)列可能(neng)(neng)會與錯(cuo)誤配對序(xu)列雜交(jiao)，降低了特(te)(te)異(yi)性(xing)，而且比短序(xu)列雜交(jiao)慢(man)，從而降低了產量(liang)。

2、選(xuan)擇(ze)GC含(han)量為(wei)40％到60％或GC含(han)量映像模(mo)板GC含(han)量的(de)引物。

3、設計5'端和中間區(qu)為G或C的引物(wu)。這(zhe)會增(zeng)加引物(wu)的穩(wen)定(ding)性(xing)和引物(wu)同目(mu)的序(xu)列雜交(jiao)的穩(wen)定(ding)性(xing)。

4、避免引(yin)物(wu)對(dui)3'末(mo)端存在互(hu)補序列，這會形成引(yin)物(wu)二聚(ju)體(ti)，抑(yi)制擴(kuo)增。

5、避(bi)免3'末端富含GC。設(she)計引物(wu)時保證(zheng)在最后5個核(he)苷中含有3個A或T。

6、避免3'末(mo)端(duan)的錯誤配對。3'端(duan)核(he)苷(gan)需要同模板退火以供聚(ju)合酶催化延伸。

7、避免存在可能(neng)會(hui)(hui)產(chan)生(sheng)內(nei)部(bu)二級結構的序列，這(zhe)會(hui)(hui)破壞(huai)引物退火(huo)穩(wen)定性。

目(mu)的(de)序(xu)列上并不存在的(de)附加序(xu)列，如限制位點和啟動子序(xu)列，可以加入到引(yin)物(wu)(wu)5'端(duan)而不影響(xiang)特異性(xing)(xing)。當(dang)計算(suan)引(yin)物(wu)(wu)Tm值時并不包括這些序(xu)列，但是應(ying)該對其進(jin)行互(hu)補性(xing)(xing)和內(nei)部二級結構的(de)檢測。

有(you)時候，對于引物(wu)設計僅了解有(you)限的(de)(de)(de)序(xu)列信息。比如，如果僅知道氨基酸(suan)序(xu)列，可(ke)(ke)以設計兼(jian)(jian)并(bing)引物(wu)。兼(jian)(jian)并(bing)引物(wu)是指代表編(bian)碼(ma)單個氨基酸(suan)所(suo)有(you)不(bu)同堿(jian)基可(ke)(ke)能性(xing)(xing)的(de)(de)(de)不(bu)同序(xu)列的(de)(de)(de)混合(he)物(wu)。為了增加(jia)特(te)異(yi)性(xing)(xing)，可(ke)(ke)以參(can)考密碼(ma)子使(shi)用表，根據不(bu)同生物(wu)的(de)(de)(de)堿(jian)基使(shi)用偏(pian)好，減少兼(jian)(jian)并(bing)性(xing)(xing)。次(ci)黃嘌(piao)呤可(ke)(ke)以同所(suo)有(you)的(de)(de)(de)堿(jian)基配對，降低引物(wu)的(de)(de)(de)退(tui)火溫(wen)度(du)。不(bu)要在(zai)引物(wu)的(de)(de)(de)3'端(duan)使(shi)用兼(jian)(jian)并(bing)堿(jian)基，因為3'端(duan)最后(hou)3個堿(jian)基的(de)(de)(de)退(tui)火足(zu)以在(zai)錯誤位(wei)點起始PCR。使(shi)用較高(gao)的(de)(de)(de)引物(wu)濃度(du)（1μM到(dao)3μM），因為許多兼(jian)(jian)并(bing)混合(he)物(wu)中的(de)(de)(de)引物(wu)不(bu)是特(te)異(yi)性(xing)(xing)針對目的(de)(de)(de)模板。