細胞冷凍過程四個要點敘述

        一(yi)個實驗室得到(dao)一(yi)個新(xin)的(de)細胞(bao)株后，首先要把(ba)該細胞(bao)株培(pei)養(yang)擴增后凍(dong)(dong)存(cun)起來。細胞(bao)凍(dong)(dong)存(cun)首先可(ke)以在(zai)由于污染等情(qing)況丟失細胞(bao)時(shi)有備份可(ke)用，另外幾(ji)乎所有細胞(bao)在(zai)培(pei)養(yang)傳(chuan)代的(de)過程中發生(sheng)一(yi)定程度的(de)變異，為了保(bao)持實驗結果的(de)一(yi)致，一(yi)般細胞(bao)在(zai)培(pei)養(yang)幾(ji)十代以后就不能(neng)再使(shi)用了，需要將凍(dong)(dong)存(cun)的(de)，傳(chuan)代較少(shao)的(de)細胞(bao)化(hua)凍(dong)(dong)培(pei)養(yang)再使(shi)用。細胞(bao)冷(leng)凍(dong)(dong)過程有四個要點：細胞(bao)的(de)收獲、保(bao)護劑的(de)使(shi)用、冷(leng)凍(dong)(dong)速率和儲存(cun)環境。

1、 細胞的收獲

用來凍(dong)存的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)一(yi)(yi)(yi)般選擇(ze)在細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)約鋪滿 90% 的(de)(de)時(shi)候(hou)，這時(shi)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)生長(chang)狀態好，細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)數量也多，并且在收(shou)(shou)獲(huo)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)前 24 小時(shi)換一(yi)(yi)(yi)次培(pei)養液。收(shou)(shou)獲(huo)用來凍(dong)存的(de)(de)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)開始時(shi)方法和平時(shi)一(yi)(yi)(yi)樣(yang)，用 100xg 離心 5 分(fen)(fen)鐘(zhong)收(shou)(shou)集細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)再重懸，活細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)記數。稀釋或濃縮到(dao)細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)保存的(de)(de)最終細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao)濃度(du)的(de)(de)二倍(bei)(一(yi)(yi)(yi)般是(shi) 400-1000 萬 細(xi)(xi)(xi)(xi)胞(bao)(bao) /ml )，加入已(yi)經配好的(de)(de)等體積的(de)(de)培(pei)養液保護劑混合(he)溶液中輕(qing)輕(qing)混勻，分(fen)(fen)裝到(dao)凍(dong)存管(guan)，冷凍(dong)保存。

2、保護劑的使用

細(xi)(xi)(xi)胞(bao)凍(dong)存(cun)(cun)中， 一般使用(yong)DMSO 作為保護劑(ji)。在細(xi)(xi)(xi)胞(bao)凍(dong)存(cun)(cun)中， DMSO 使用(yong)的最終(zhong)濃(nong)度(du)一般是(shi) 5-15% ，某種具體細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的凍(dong)存(cun)(cun)液(ye)中的DMSO濃(nong)度(du)可以從ATCC查到。對(dui)特別(bie)(bie)敏感的細(xi)(xi)(xi)胞(bao)特別(bie)(bie)是(shi)雜交(jiao)瘤(liu)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)在凍(dong)存(cun)(cun)時(shi)使用(yong) 95% 血清(qing)和(he) 5%DMSO 可能會好些。保護劑(ji)在使用(yong)時(shi)先用(yong)培養(yang)(yang)液(ye)或血清(qing)配成最終(zhong)濃(nong)度(du)的2倍，再與等體積(ji)的懸(xuan)浮細(xi)(xi)(xi)胞(bao)的培養(yang)(yang)液(ye)混(hun)合。

3、細胞凍存的速率

細(xi)(xi)胞(bao)的(de)冷凍速率最適控制在(zai)(zai)讓細(xi)(xi)胞(bao)有足夠的(de)時(shi)(shi)間脫(tuo)(tuo)水(shui)而又不被過度脫(tuo)(tuo)水(shui)導致細(xi)(xi)胞(bao)損害。對大多(duo)數(shu)細(xi)(xi)胞(bao)來說，每分鐘降 1 至 3 ℃是合適的(de)。通常的(de)操作是把細(xi)(xi)胞(bao)先在(zai)(zai)-20℃1-2個小時(shi)(shi)，再放入(ru) -80℃冰(bing)箱(xiang)過夜(如果沒有-80℃冰(bing)箱(xiang)，可以用干冰(bing)替(ti)代(dai))，再轉入(ru)液氮(dan)罐或低于(yu) -130℃的(de)冰(bing)箱(xiang)長期保存。

4、儲存環境

細胞長期保存(cun)溫度(du)是(shi) -130 ℃或更(geng)低。液(ye)(ye)氮罐中(zhong)氣(qi)態(tai)層溫度(du)在(zai) -140℃至 -180℃之(zhi)間(jian)，細胞可(ke)(ke)保存(cun)在(zai)氣(qi)態(tai)層或浸(jin)入液(ye)(ye)氮中(zhong)，如(ru)果可(ke)(ke)能(neng)最好保存(cun)在(zai)氣(qi)態(tai)層，因為這(zhe)樣(yang)可(ke)(ke)避免(mian)由(you)于有液(ye)(ye)氮進入凍(dong)存(cun)管而(er)在(zai)拿出(chu)細胞時引(yin)起爆(bao)炸(但是(shi)這(zhe)樣(yang)液(ye)(ye)氮罐內只(zhi)能(neng)存(cun)儲少(shao)量液(ye)(ye)氮，需要經(jing)常添(tian)加(jia))。細胞也可(ke)(ke)以在(zai)-80℃冰箱(xiang)保存(cun)幾個月左右的(de)時間(jian)。