一、 貼壁細胞傳代（以一個T25瓶為例）

1、 吸(xi)出(chu)原培養液；

2、 加入2ml左右(you)PBS，輕輕晃動培養(yang)瓶(ping)潤洗細胞，吸出PBS丟棄；

3、 加入1ml左右(you)胰(yi)酶，輕輕晃動培養瓶使之浸潤所有(you)細胞，放入培養箱消化(hua)；

4、 消(xiao)化時間跟據細胞特性有所(suo)不同，顯微(wei)鏡下看到細胞塊中間的細胞明顯分離變圓，側立培養瓶(ping)細胞可(ke)以滑落(luo)時可(ke)終止消(xiao)化，全程不要(yao)拍打培養瓶(ping)；

5、 加入3ml含血清的培養基終止(zhi)消化，吹打(da)細胞使之(zhi)脫落并(bing)在液(ye)體里(li)反復(fu)吹打(da)使細胞，使之(zhi)盡量呈單顆細胞的懸浮液(ye)，這時可以在顯(xian)微鏡(jing)看(kan)下；

6、 收(shou)集(ji)細胞懸(xuan)液(ye)離(li)心(xin)，1200rpm（約250g） 3分鐘，離(li)心(xin)完吸(xi)出上清丟棄。

7、 加入新鮮(xian)培養基(ji)，吹打(da)幾(ji)下混勻細(xi)胞即可，按需接種到新培養瓶(ping)，補足培養基(ji)，擰松瓶(ping)蓋(gai)或使用透(tou)氣瓶(ping)蓋(gai)進行培養。

8、 檢查培養箱二氧化碳，溫度(du)和水盤。

二、 懸浮細胞傳代（以一個T25瓶為例）

1、 輕輕吹散懸(xuan)浮細胞(bao)，部分貼壁松散的懸(xuan)浮細胞(bao)可直(zhi)接吹打培養瓶底部使細胞(bao)懸(xuan)浮，收(shou)集(ji)細胞(bao)懸(xuan)液到(dao)無菌離(li)心(xin)管中，離(li)心(xin)1200rpm（約250g） 3分鐘(zhong)，離(li)心(xin)完畢吸出(chu)上清丟(diu)棄;

2、 加入(ru)適量(liang)新鮮培養(yang)基重懸細胞(bao)，按比例接(jie)種至培養(yang)瓶（接(jie)種比例按實際情況，不確定(ding)可計數后再接(jie)種）;

3、 常規細胞推薦(jian)以3~5×105cells/ml傳代，長到2×106cells/ml傳出(chu);

4、 建議剛開始幾代計數后傳代，后面可以根據(ju)經(jing)驗按比(bi)例傳代。

三、 半貼壁半懸浮細胞傳代（以一個T25瓶為例）

1、 培養液(ye)(ye)（含(han)懸(xuan)浮的細胞）：用移(yi)液(ye)(ye)器(qi)吸出培養液(ye)(ye)轉移(yi)到無菌離心管中；

2、 貼壁部分：用1ml PBS洗(xi)細胞(bao)，吸出PBS放入到第1步裝有(you)培養液的離心管中收集（不要直接丟棄，里面有(you)細胞(bao)）；

3、 培養(yang)瓶加入胰酶1ml，放入培養(yang)箱靜置消化；

4、 消化時間跟據細胞(bao)特性(xing)有所不同，顯微鏡下看到細胞(bao)明(ming)顯收縮變圓(yuan)，側立(li)培養瓶(ping)細胞(bao)可以滑落(luo)時可終止消化，全程不要拍(pai)打培養瓶(ping)；

5、 用3ml含血清的(de)培養基終止消化，將消化下來(lai)的(de)細胞懸液(ye)吹散細胞后收集到(dao)第1步(bu)的(de)離心(xin)管(guan)；

6、 將離(li)心(xin)管在1200rpm（約250g） 3min離(li)心(xin)，離(li)心(xin)完畢棄(qi)掉(diao)上(shang)清，加入新的培(pei)養(yang)基重懸，按實際情況分瓶(ping)，放入培(pei)養(yang)箱(xiang)培(pei)養(yang)。

溫馨提示：

1、 每丟棄一(yi)個液體前(qian)都要想一(yi)下里面有沒有可能(neng)有細胞(bao)(bao)，避免丟失細胞(bao)(bao)。

2、 細(xi)(xi)胞種類(lei)、細(xi)(xi)胞密度、細(xi)(xi)胞狀(zhuang)(zhuang)態、甚至胰酶的品牌，均影響到細(xi)(xi)胞的消化時間(jian)(jian)，所以(yi)消化的時候不要只看時間(jian)(jian)，以(yi)顯(xian)微鏡下細(xi)(xi)胞的狀(zhuang)(zhuang)態來確定消化終點，部(bu)分(fen)難消化的細(xi)(xi)胞消化時間(jian)(jian)甚至可以(yi)長(chang)達15分(fen)鐘(zhong)。

3、 細胞(bao)的(de)(de)傳(chuan)代(dai)比例(li)通常說的(de)(de)是(shi)(shi)等體積的(de)(de)容器(qi)(qi)，不同(tong)容器(qi)(qi)需要換(huan)算；例(li)如(ru)：一個(ge)T25培(pei)(pei)養(yang)(yang)瓶的(de)(de)細胞(bao)傳(chuan)到(dao)一個(ge)10cm培(pei)(pei)養(yang)(yang)皿(min)里面，雖然是(shi)(shi)1傳(chuan)1，但是(shi)(shi)比例(li)可不是(shi)(shi)1:1；T25瓶底面積25cm2，10cm培(pei)(pei)養(yang)(yang)皿(min)底面積約為(wei)(wei)55cm²（10cm的(de)(de)培(pei)(pei)養(yang)(yang)皿(min)指(zhi)的(de)(de)是(shi)(shi)培(pei)(pei)養(yang)(yang)皿(min)的(de)(de)外徑，而培(pei)(pei)養(yang)(yang)皿(min)的(de)(de)內徑約為(wei)(wei)8.4cm，故(gu)根據內徑可求出其底面積為(wei)(wei)55cm²），所(suo)以(yi)實際傳(chuan)代(dai)比例(li)為(wei)(wei)1:2.2。

4、 在(zai)有關(guan)離(li)心機的(de)(de)實(shi)(shi)驗(yan)(yan)中(zhong)，標準(zhun)的(de)(de)離(li)心條件應該(gai)是用(yong)RCF(relative centnifugal fieldt)來衡量，而在(zai)實(shi)(shi)際大家(jia)實(shi)(shi)驗(yan)(yan)過(guo)程中(zhong)，往往習慣用(yong)rmp即每分鐘轉速(su)來表示(shi)；RCF即表示(shi)相對離(li)心場，以(yi)重力(li)加速(su)度g(980.66cm/s2)的(de)(de)倍數來表示(shi)；RCF=1.119×10-5×(rpm)2×r（其中(zhong)r表示(shi)離(li)心機轉軸中(zhong)心與(yu)離(li)心管中(zhong)心的(de)(de)距離(li)，單位為cm）；所以(yi)每個實(shi)(shi)驗(yan)(yan)室(shi)離(li)心機轉速(su)設置是不(bu)一(yi)樣的(de)(de)，常規建議(yi)1200rpm 大約250g。